Пташне - Переключение генов - 1988, страница 5

Рис. 1.8. Репрессор в лизогенвой клетке. Большая часть репрессора в таких клетках находится в виде димеров. Единственная хромосома Е.сои содержит один интегрированный профаг, с которым прочно связывается репрессор. Остальные димеры слабо ассоциированы с другими участками бактериальной хромосомы или находятся в клетке в свободном состоянии.

17 Ьа Рис ! 9 Димер репрессора связан с одним из операторных участков длиной 17 пар оснований Каждый амино-концевой домен располагается посередине определенного участка большого желобка (мы еще вернемся к этому в гл 2) концевыми доменами, так как первый из них содержит первую аминокислоту белковой цепочки, а второй — последнюю. Две цепи, показанные на рис. 1.6 и называемые мономерами, ассоциируют с образованием димеров (рис. 1.7). Димер формируется главным образом за счет контактов между карбокси-концевыми доменами; амина-концевые домены вносят лишь небольшой вклад в это взаимодействие. В лизогенной клетке примерно 95% молекул репрессора ассоциированы в димеры (рис.

!.8). Димеры репрессора использую~ свои амино-концевые домены для связывания с ДНК (рис. 1.9), причем каждый из трех участков, входящих в состав О„, может связываться с одним димером репрессора. Димер репрессора связывается в каждом участке с одной стороной двойной спирали. Белок Сто Белок Сто (рис. 1.1О) состоит всего из 66 аминокислот, образующих один домен. Сродство мономеров Сго друг к другу очень велико, и в клетке практически все молекулы Сто находятся в виде димеров. В отсутствие репрессора Сго може~ связываться с тремя операторными участками Он.

На рис. 1.11 бв аминокислотт С: „> Иономеп Лвмев Рис ! ! О Белок Сто фага Х Мономер Сто состоит всего из бб аминокислотных остатков, но склалывается в глобулярную структуру, размер которой близок к размеру амино-концевого домена репрессора 27 пар Рнс 1.11 Димср Сго-белка, связанный с операторным участком длиной 17 пар осчоватой Сто-бслок связывается на той же стороне двойной спирали, ч~о н димер рспрессора.

показано, что один димер Сго связывается с одной сзороной двойной спирали каждого операторного участка и располагается при этом точно в том же месте. что ги димер репрессора. Эти два белка, репрессор и Сто, связываются с одними и теми же операторными участками, но играют противоположные роли в механизме переключения. Действие репрессори и Сто Чтобы понять механизм действия репрессора, нужно прежде всего выяснить, к чему может привести связывание его с участком Оя2 при условии, что 0„1 и 0„3 остаются свободными. Такое связывание в норме никогда не наблюдается 1почему зто так, мы объясним ниже), однако его можно обеспечить экспериментально.

Рис. 1.12 показывает, что репрессор, связавгпийся с Ок2, выполняет две функции, необходимые для Зыка. вкл. Рис. 1.12. Репрсссор, связанный с 0„2. В лизогенной клетке рспрессор никогда ие связывается с 0„2, пока он не свяжется с 0„1. Если же он все-таки свяжется с 0,2„го включится промотор Раи и выключится Ра, гак что будет транскрибировагься только ~егг г1, но не ген гго. Подобно тому как белок-белковыс взаимодействия удерживают вместе два мономера репрессора в составе лимера, взаимодействие между амино-концсвым доменом репрсссора н по.

нимеразой помогает ферменту связаться с промотором Р, и начать с него транскрипцию. поддержания лизогенного состояния: он выключает ген ггп и поддерживает включенным ген репрессора. Посмотрим геперь, какие механизмы лежат в основе этих функций. Негативнаи регуляция Репрессор, связанный с Оя2, выключает ген его, препятствуя связыванию РНК-полимеразы с Рк. Такой эффект обусловлен тем, что Сто закрывает участок ДНК, который должен быть доступен, чтобы полимераза связалась с Р„. Когда репрессор занимает 0„2, РНК-полимераза не имеет доступа к той последовательности, которую ей необходимо опознать в промоторе.

Этот принцип взаимно исключающего связывания лежит в основе многих механизмов негативной регуляпии. Позитивная регуляция Репрессор, присоединившись к Ох2, ломогаещ РНК-полимеразе связаться и начать транскрипцию с Р; именно этот промотор обеспечивает транскрипцию с! в лйзогенной клетке, Эффективность транскрипции увеличивается примерно в 10 раз. Репрессор получил свое название благодаря способности выключать все остальные фаговые гены. И лишь позднее стало ясно. что он является также позитивным регулятором, усиливая транскрипцию своего собственного гена.

Предполагаемый принцип действия репрессора в качестве позитивного регулятора иллюстрирует рис. 1.12; репрессор, находящийся на Оа2. контактирует с РНК-полимеразой, связанной с Р Димер репрессора, связанный с 0„2. увеличивает сродство полимеразы к промотору, поскольку она удерживается здесь не только благодаря контактам с ДНК, но ~ акже за счет белок-белковых взаимодействий с репрессором. В итоге димер репрессора, связанный с 0„2. подавляе~ промотор Р„, исключая связывание с ним РНК-полимеразы.

и способствует транскрипции с Р „. Он подавляет гранскрипцию в направлении слева направо, но стимулирует транскрипцию, идущую влево. (Как будет показацо в гл. 2, шо различие объясняется тем, что 0„2 расположен несколько ближе к Р . чем к Р„„.) Рассмотрим теперь действие единственного димера репрессора, связанного с Оа! или с 0„3. Как видно из рис. !.13, репрессор, связанный с 0„1, блокирует присоединение полимеразы к Рх, но расположен слишком далеко, чтобы повлиять на полимеразу.

связанную с Р„м. Р„работает очень слабо и изображен на рисунке выключенным, поскольку репрессор не связан с Ок2. Как показано на рис. 1.14, репрессор. сидящий на Оа3, блокйруег связывание полимеразы с Р н не оказывае~ никакого действия на Рк.

оаг оат о„з Рис. 1.13. Репрессор, связанный с 0„1. Когда репрессор присоединен только к О,!, он блокирует связывание полимеразы с промотором Р„, но не препятствует ее связыванию с Рки. Тем не менее Рц„так ке выключен, так как на участке Оа2 нет молекулы репрессора, способствуюгиего связыванию полимеразы. Рис. !.14. Репрессор, связанный с 0„3. Если репрессор связан только с Окз, ов не оказывает никакого действия на промотор Р, н этот промотор включен. Р,н при этом выключен. > 901ь < 10% Рис. 1.15. Оператор ь в лизогенной клетке. Днмеры репрессора связаны в первую очередь с участками 0„! и 0,2, а иногда закис с 0„3. Если сделать ряд моментальных снимков того, что происходит внутри лизогенной клетки, содержащей профаг 3., то мы увидим следующее (рис.

1.15). Димеры репрессора почти всегда связаны с О„! и О 2, а О 3 обычно свободен от репрессора. Такое расположение молекул репрессора на О„приводит к выключению Р„и поддерживает Р во включенном состоянии; происходит синтез репрессора™но не белка Сто. Чем же определяется такое связывание репрессора прн лнзогении? 30 Кооперативное связывание репрессора Связывание димеров репрессора с тремя операторными участками определяется двумя факторами. Первый из них-сродство димера к каждому из трех участков по отдельности, второй-взаимодействие между димерами репрессора, связанными с соседними участками. Подобно тому как репрессор, связанный с Ок2, способствует связыванию полимеразы с промотором Р „, репрессоры могут взаимодействовать друг с другом, облегчая связывание.

Представим себе димер репрессора, который приближается к свободному оператору. Хотя репрессор может попробовать связаться с каждым из трех участков, обычно он закрепляется на Ок1, как это показано на рис. !.16; другими словами, 0„1 обладает наиболыпим сродством к репрессору из трех участков связывания. Этот акт связывания сразу же увеличивает сродство 0„2 ко второму димеру репрессора, так как второй димер контактирует не только с 0„2, но и с уже связавшимся репрессором. Результат взаимодействия между репрессорами, находящимися на участках Ок1 и Ок2, состоит в том, что эти два участка заполняются практически одновременно.

Рис. 1.! 6 показывает также, что при повышении концентрации репрессора заполняются не только Оя! и Ок2, но и Ок3. Как было сказано выше, в результате связйвания репрессора с 0„3 промотор Р выключается. Участок Ок 3 связывает репрессор слабее, чем 0 2, хотя собственное сродство этих двух участков к репрессору примерно одинаково и приблизительно в 1О раз ниже, чем участка 0„1.