Пташне - Переключение генов - 1988, страница 6

Связывание репрессора с Ок2 облегчается благодаря взаимодействию с другой молекулой репрессора, сидящей на 0 1, тогда как с О 3 репрессор связывается независимо. Почему репрессор, сидящий на Ок2, помогает полимеразе связаться с Р„„, но не помогает другой молекуле репрессора связаться с 0„3? Ответ на этот вопрос дает рис. 1.16 и более подробно-рис. 1.17. Во взаимодействии соседних димеров репрессора друг с другом участвуют карбокси-концевые домены.

Когда димер репрессора, сидящий на участке Ок2, взаимодействует с другим димером на 0„1, он уже не способен взаимодействовать с димером на 0„3. Мы предполагаем, что при взаимодействии димеры, связанныс с Ок! и Ок2, наклоняются друг к другу. Это может происходить благодаря гибкости пептидного мостика, соединяющего амино- и карбокси-концевые домены. Димер, связанный с 0„2, изображен на рис. !.16 наклоненным вправо; он контактирует с димером на Ок! и не может одновременно контактировать с димером, сидящим на Оя 3.

Поэтому участок Ок3 заполняется независимо. Однако репрессор на Ок! способен взаимодействовать с полимеразой, связанной с Р„„, так з! Ояз оаз ояз а Ф о,з о„з о„т ч о м Рис. й!7. Взггивголсйствие между соседними пимерами репрсссорв. Мостик. связывающий амине-концевой домен рспрессора с карбокси-концевым доменом, досза точно гибок, полому репрессор.

находящийся на 0„2, может контактировать с репрсссором на Окй Рис. 1 16. Связывание репрессора с тремя участками 0„. Связь репрессора с Ок ! примерно в 1О раз прочнее, чем с Оа2 и 0,3. так что репрсссор связывается прецпо питеяьио с ()а! Вторая молекула репрсссора очень быстро связывается с 0,2, тогда каь 0 3 по-прежнему слабо связывает рспрессор и запогщяется только при более высокой его ковпенграпин.

овт мтзаатяый Участок Оя1 о„з как в этом контакте участвует амино-концевой домен репрессора, который взаимодействует также с ДНК. Один из аминоконцевых доменов расположен именно так, что может контактировать с полнмеразой. Если мы правильно описали взаимодействие димеров репрессора на участках 0„1 и 0„2, то можно предположить, что в отсутствие репрессора на участке 0„! репрессор на Ои2 наклонится влево и будет взаимодействовать с молекулой репрессора на Ок3. Действительно, если участок Ои1 изменен или делегирован, так что с ним не может связаться репрессор, то димеры на 0„2 и Ои3 взаимодействуют между собой. В этом случае лимеры репрессора заполняют участки Ои2 и Оя3 одновременно, как показано на рис.

1.18. Описанные нами белок-белковые взаимодействия представляют собой пример кооперативности. Так, молекулы репрессора кооперативно связываются с Ои1 и Оа2. Поскольку димеры репрессора взаимодействую~ друг с другом на Оя! и Ои2 или на 0„2 и Ои3, мы говорим об альтернативной пойарной кооперативност и участков связывания. Индукция— переключение регуляторного аппарата В лизогенных клетках репрессор, связанный с Оя! и О 2, поддерживает ген гто в выключенном состоянии и в то же время стимулирует транскрипцию своего собственного гена с1, как это показано на рис. 1.19. По мере роста и деления клеток происходит постоянный синтез репрессора, тогда как ген сто остается выключенным.

Если концентрация репрессора увеличивается (например, при временном подавлении деления клетки), то репрессор связывается также с Ои3 и выключает собственный ген. Когда клетка снова начинает делиться и концентрация репрессора падает до определенного уровня, ген ) зз1 Рис 1 18 Взаимодействие мсжлу молекулами репрессора, связанными с участками Оя2 и Ок3 Если 0„1 несет мутацию, исключаюпгую связывание с ним рспрессора, то репрессор, находящийся на Оя2, может свободно взаимо. действовать с другой молекулой репрессора.

связанной с 0„3 Это взаимодействие увеличивает сродство репрессора к 0 2 и 0„3 примерно в 5 раз по сравнению с его сродством к этим участкам по отдельности. Рис ! !9 Рспрессор и РНК-полнмераза в лизогеиной клетке Репрессор, связанный с Ое! и 0,2, стимулирует промотор Р„и н одновременно выключает Р„ ЧФ-свет ЮРъР~Р~~ Рнс ! 20 Расгисплснне репрессора белком КесА. Оно происходит мсткду амииокислотными остатками аланнном н тлндином в участке.

связываюгисм домены репрессора друг с другом г1 вновь начинает работать, обеспечивая синтез репрессора. Так поддерживается постоянный уровень репрессора в клетке. не зависящий от колебаний скорости роста. В клетке репрессор время от времени отделяема от оператора, но почти сразу же снова присоединяется к нему или его заменяет другая молекула репрессора, оказавшаяся неподалеку. Концентрация репрессора достаточно высока для того. чтобы в любой момент времени Ок1 и 0„2 с высокой вероятностью были заполнены. Таким образом, в отсутствие индуцирующего воздействия лизогенное состояние сохраняется почти бесконечно.

Теперь мы готовы к тому, чтобы понять, как УФ-облучение кардинальным образом изменяет поведение лизогенных кле- Рис ! 2!. Расщепление репрессора и индукпия Расщсплснныс молекулы рспрессора не могут образоаыаать димеры. позгому а результате облучения оии отсосдиняются от оператора и ие замещаются другими молекулами. Ояз Рис !.22. Связывание белка Сго с Оя. Днмеры Сто независимо саязыящо~ся с каждым из трех участков оператора. ток.

Начало этих драматических событий показано на рис. !.20. Мишенью УФ-облучения и других индуцирующих воздействий является ДНК. Не совсем понятным образом повреждение в ней вызывает заметное изменение в поведении одного бактериального белка, который называешься КесА. В обычных условиях КесА катализирует рекомбинацию между молекулами ДНК, но если в ДНК появляются повреждения, этот белок становится также высокоспецифичной протеазой, которая расщепляет мономеры репрессора Х. (КесА расщепляет также другие репрессоры, включая таким образом гены, которые позволяют нелизогенным клеткам пережить УФ-облучение; без КесА такое облучение было бы летальным.

Подробнее это явление описано в гл. 3.'! ОдЗ Од2 Од1 Одз Од2 Од1 Рис 1 23 Порядок связывания димеров Сто с участками, сосз авляющими Од Сродсгво Сто к участку 0„3 примерно в 10 раз выше, чем к О„! н 0„2 После того как первый димер Сто связался с 0„3, второй димер связывается с 0„1 или 0„2 Белок Сто заполняет участки оператора в обратном порядке, чем репрессор Таким образом, по сродству к белку Сто участки немутантпого оператора Од располагаются в следующем порядке Од3 > 0„1 = 0„2, а по сродству к репрессору — 0„! > Од2 = 0„3 Ввд.

Вывл Рис 124 Действие белка Сто Сначала Сто подавляет синтез репрессора с промотора Рди. а затем включает свой собственный ген 3б На рис. 1.20 показано, что расщепление происходит в определенном месте, расположенном в участке репрессора, соединяюшем амино- и карбокси-концевой домены. Отделение карбокси-концевого домена от амино-концевого полностью инактивирует репрессор, так как изолированные амино-концевые домены не могут димеризоваться, а их сродство к оператору в мономерной форме слишком низко, чтобы обеспечить эффективное связывание при той концентрации, какая существует в лизогенных клетках. Теперь после отделения димера репрессора от оператора его печем замени~ь (рис. 1.21). Это ведет к двум последствиям.

Во-первых, по мере того как репрессор освобождает Ок1 и 0 2, скорость его синтеза падает (поскольку репрессор необходим для поддержания транскрипции своего собственного гена); во-вторых, полимераза связывается с Р„и начинает транскри1Шию сго. Теперь именно белок Сго определяет ход событий. Действие Сго проще, чем действие репрессора. Как показано на рис. 1.22, димеры Сго связываются независимо (не кооперативно) с тремя участками Ок. В отличие от репрессора Сго-белок со строго негативной регуляцией. Главная особенность функционирования Сго состоит в том, что три участка О„по сродству к нему располагаются в обратном порядке по сравнению с таковым для репрессора.

На рис. 1.23 показано, что первая синтезированная молекула Сго связывается с Оа3. Это препятствует связыванию полимеразы с Р и подавляет дальнейший синтез репрессора. К этому момейту переключатель генов сработал и начался литический цикл. Пока Ря продолжает работать и ген сго транскрибируется, транскрибйруются также и гены, лежащие справа от сто, продукты которых необходимы на ранних стадиях литического цикла (гл. 3). Синтезируется все болыпе белка Сто, пока его концентрация не достигнет уровня, при котором заполняются также участки Оа1 и Оя2 и связывание полимеразы с Рк подавляется (рис. 1.24). Таким образом, белок Сго вначале выключает синтез репрессора, а несколько позже выключает (или снижает) экспрессию своего собственного гена и других ранних литических генов.

Кооперативность: устойчивость и чувствительность переключатели генов Мы описали три вида кооперативности с участием белок-белковых взаимодействий, которые обеспечивают высокую эффективность механизма переключения. ° Во-первых, моцомеры репрессора образуют димеры— ДНК-связывающую форму репрессора. Эти димеры свободно 37 днссоциируют на мономеры, и в клетке мономеры и димеры нахсзлятся в равновесии. Описывая связывание димера, можно сказать, что один мономер способствует связыванию другого с оператором, т.е. два мономера кооперативно связываются с одним операторным участком. ° Во-вторых, димеры кооперативно связываются с соседними участками оператора. Основное проявление этой кооперативности состоит в том, что димер репрессора, находящийся на Ок!, способствует связыванию другого димера с Ои2.

° В-третьих, репрессор на Ок2 помогает полимеразе связаться и начать транскрипцию с Р„м, Общий результа~ этих проявлейий кооперативности наглядно иллюстрирует рис. 1.25, на котором приведены кривые зависимости активности Р„от концентрации репрессора. Обратите внимание, что при лизогении синтезируется достаточное количество ренрессора„чгобы уменыцить эффективность промотора Ря примерно в 1000 раз. При падении концентрации репрессора в 2 -3 раза по сравнению с этим максимальным уровнем активность Р„не изменяется.

В резульпате состояние репрессии оказывается защищенным от обычных колебаний концентрации репрессора, так что нслучайная» инлукция лизо- Х ж и и сь Ю о. 5О Кпицевтрапия репрессапа Рис. 1.25 Зависимость репрессии от концентрации репрессора в двух системах. Черная кривая показываец чго состояние репрессии в лизогснной клетке подлерживается только ло тех пор, пока концентрация репрессора не упадет примерно в 5 раз. Даже небольшое дальнейшее снижение концентрации репрессора вызывает резкое изменение в работе системы.