Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.2 (Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - 2001), страница 11

Кесепг1у, ап ас)йг!опа1 тегЬос1 — зрш сПа1уяз гЬгоиПЬ а рогоиз тетЬгапе — Ьаз Ъесопъе ъч)с)е1у рори1аг, ъчЬ!сЬ гз огЫ Ьесаые зргп сПа!уяз гз з!оъчег, 1езз ейк1епс, апс) 1езз аЫе йап сЬготагоПгарЬу го г)еа! ъчЬЬ гпапу загпр!ез япш1гапеоиз!у 1е.8., р1еазе зее Меле! апс1 8гоггз 1994). Оезр!ге гЬезе ргоЫетз, зр!и йа!уяз, !г' сагг!ес) оиг сагебгПу, сап гергоь!ис!Ыу с)еПчег ашр66еь! ТъИА !п геазопаЫе у)е!д апс! ггее ог" я8п)6сапг атоипгз о! с)ХТРз апъ! о1г8опис!еогЫез. Риг!п8 зргп сПа1уяз, гЬе зо1чепг, го8егЬег ъч)гЬ!оъч-то!еси1аг-ъче!ПЬг зо1игез, )з сепгг!1и8ес) ГЬгои8Ь ап ап)зоггор!с, Ьус!горЬП!с, попаЬзогЬепЬ рогоы пгепъЬгапе.

Масгото!еси!ез !агВег йап гЬе гпегпЬгапе рогез аге гегашег! !и гЬе загпр1е гезегчог ш а япаП чо!шпе оу зо1чепг. РоПоъч)п8 гегпоча1 ог" йе зо!игез, гЬе сопсепггагес! загпр1е )з гесопзг!гигес! го йе ог!8)па!чо)ите из!п8 гЬе с)еягес! зо!чепи ТЬгз ргосезз гз гереагес) ипгП йе сопсепггагюп ог' гЬе ог18)па1 зо1шез гз гес!исес) со ассергаЫе 1ечеЬс Сопипегсга! сопсепггагогз аге зиррПес) ъч)гЬ гпетЬгапез ог" зечега1 ъ!Негепс рогоз!Пез гЬаг аге сЬагасгепхес1 Ьу а попипа1 то1еси1аг-ъче!8Ьг сиг-о6. Рог гегпоча! о! о!г8опис!еогЫез, апъ) г!!ъ!Трз, Сепгпсоп-100 ог Мкгосоп-100 писгосопсепггагогз, ъчЬ)сЬ ге!а!и ргогешз ъч!гЬ а гпо1еси1аг ъче!ВЬг ог' >100,000, аге гои6пе!у ыес).

ТЬезе с)ечкез аПоъч оППопис!еог)г!е рптегз ир го 48 Ьазез !п 1еп81Ь го раза гЬгоиПЬ йе 61сег, апс1 йеу геса!и Пои- 8.27 8.28 СЬаргег 8: )п РТ(го Атр!г)гсаггоп о)' Т)ХА Ьу РСЯ Ые-ягапс)ег( РСК ргос(исса аа япа11 аа 125 Ьр (Кгоччсгупа)са апс1 Непдегаоп 1992). 1.опВег 0118оппс1ео1Ыеа аге Ьея гегпочес1 Ьу рип(у(п8 (Ье ашр116ед Т)ХА Ьу Ве! е1есггорЬогеяа. ТЫа ргогосо! (а а шос)16ег! чегяоп о( а шегЬос( аирр1(ес! Ьу М.В.

Непг!егаоп 1Ьаг ччак оп8- гпа11у с(еасг(Ьег) Ьу Кгоччскупа)са апд Непг)егаоп (1992). МАТЕИАсБ СА()Т1ОЫ: Р!еаае аее Аррепгих 12 (ог арргорг!а1е Ьапг(1!08 о! гоа1еиа1а гпагЬег1 чч11Ь с ! >, Вийегь апс! $01и6оп8 Р1еаае аее Аррепа!х 1 (ог согпропеп1а о( а1осЬ ао!ииопа, Ьииега, апг) геаВеп1а. О!101е агосЬ ао(ииопа 1о 1Ье арргорпа1е сопсепггаиопа.

СИого(опп с)> Ейапо! 5осбигп асегаге (3 М) ТЕ (рН 8.0) )ь(ис!е!с Ас1(Ь апс! О1фопис!ест!еВ Агпрбйсадоп геасиоп ргос(ис(х (20-200 р!) СепТгИиВеь апг! ВоТогь Ргерагаггче сепгг((иВе ог гп(его(иВе Сепспсоп-100 ошь ча!1 6г го апу Вгхед-ао8!е гогог ччпЬ адарсога сараЫе о( аоррогг!п8 17 х 150-поп гоЬез. ТЬе сепгг!(о8е гаоаг Ье сараЫе о(8епегаг!о8 а агеаг)у (огсе о(1000а. Ьисгосоп-100 оо(ь ге9шге а чаг!аЫе-ареед пг!его(о8е.

прес!а! Еци1ргпеМ Сопсепгга(ога (Сепгг(соп-100 ог М(сгосоп-100, Ат)соп) МЕТНО0 1. Р1асе 2 пг! о( ТВ (РН 8.0) гп (Ье геаегчо(г сЬашЬег о( а Сепгпсоп-100 пшг. Сагебг!1у аерагаге (Ье агпр1г6саиоп геасиоп ргодпсга Егогп (Ье иррег пппега! ог! 1ауег Ьу ргрегип8 ог Ьу ехггас6оп чч)1Ь сЫого(огш.

Тгапа(ег йе агпр166са6оп геасгюп ргос(исга го йе геьегчо(г сЬагпЪег о( йе Сепспсоп-100 ипи. 2. Р1асе гЬе епиге ипгг (пго ап арргорпаге госог о( а ргерагаггче сепгг(6а8е (е.8., а Вгхес(-ап81е гогог), !паегг 1Ье ш(сгосопсепггагог (пго (Ье сеп(НЬТВе ъч(гЬ йе 6!!гаге сир (ггапа|псепг рогиоп) Гоъчагс) йе Ъоиош о( ГЬе го(ог. ()ае а сопсеп(га(ог 61!ес( чч(й ап ег)шча!еп( апюипг о( Вше! ог а яапг(агг( Ъа1апсе гиЬе аа а соцпгегЬа1апсе. ас 1МРОКТАЫТ Оо по( ГоисЬ йе гпегпЬгапе чч!ГЬ р!Реие ог р!Реие Вра ччЬеп 1оас)!08 йе гп!сгосопсепггагог. 3. Сепгг((08е йе 1оас!ег) сопсепггагог аг 10008 гог 30 ш)ппгеь аг а гепгрегагиге Ьегъчееп 4 С апс) 25 С.

4. Кегпоче 1Ье сопсепггагог (гош (Ье сеп!г1(08е, апс1 г)(асагс( йе 61(гаге сир. !пчегг йе ипЬ, апс( гер!асе Ь (п йе сепгпйлВе (г.е., йе гесепгаге гиЬе аЬои16 почч Ье р1асес( гоччагс( гЬе Ьоггош о(1Ье гогог). Сепгг)бг8е аг 300 — 10008 (ог 2 пипи!ее. Ргогосо1 3: йеспоча! 01" О!агопис!еогиЕег апгЕ Ехсехг гГ)сГУР33$'от Атр!$)сег$ В)с!А бу Лсги!с!!гас!оп 8.29 5. Кеспоче сЬе сопсепсгасог Егош сЬе сепсгГЕиае; гегпоче йе гесепсасе сир апс$ йхсаг6 сЬе гесс оЕ сЬе с)ечке.

ТгапхЕег сЬе Е)шс$ ш 1Ье гесепсасе сир со а ЕгеаЬ гпкгоЕиае сиЬе. 6. 1Е песехаагу, ргессрЬасе сЬе аагпр1е Ьу ас$йпк опе-сепсЬ чо1шпе оЕ 3 М хойигп асесасе апг$ 2 — 3 чо1шпех оЕ есЬапо1. ТЬе ашр11Е)е6 хашр1е 1х посч геас$у 1ог хиЪхес)иепс гпашри1а6оп (1)ХА хес)пепе!08 апс$118ас)оп). А япц1е сепспЕиКассоп асер сЬгоиКЬ а Сепспсоп-100 гпешЬгапе гегпочеа -959а оГ сЬе ргсшегь ап6 деохупис1еос1с1еа Егош сЬе РСК. ТЬ14 ргосеаа а1ю спас6часеа сЬе сЬеппояаЫе !35!А ро1угпесаае ЕргеашпаЫу Ъу аЬаогрсюп со йе псепсЬгапе), А япц!е рипйса6оп асер!а ишаПу еиЕП- ссепс Гог гпоя ьиЬаеоиепс шапсри$а6оп асеря 1Е песеяагу, !гасе о1сКопис1еоссПе ргсгпега сап Ье йгйег гепючед Ъу регГогпсспК а аесопд 30-пиписе сепсг1ГиКа6оп асср. Ас 5сер 4 аЬоче, епсрсу сЬе сгапа1исепс ПЬгасе сир, геамегпЫе сЬе дечке, апд або апосЬег 2-пс! аПоиос оЕ ТЕ ЕРН 8.0) со йе геаегчой сЬашЬег.

Кереас 5сера 2 сЬгоиКЬ 4. 5шаПег-ьса1е апд Еаяег рипйса6оп сап Ье саггсе6 оис ияпа Мкгосоп-100 ип16, ТЬе очегаП ргоседиге ь сЬе ааспе аа сЬас оис1шед аЬоче ехсерс йас 400 и! о!ТЕ Ь асЫед со йе геьегчосг сЬашЬег сп 5сер 1, ГоПосчед Ьу 20 — 100 и! оЕ РСК. СепспЕиКасюп ы саггсед оис ш а чаг1аЫе-ареес$ ш!сгоуиКе ас 3000д Еог 5 — 7 шспшеа. Айаг $пчегяоп, йе аашр!е Ь сгапаЕегге6 со сЬе гесепсасе сир Ьу а ! -пипше арса ас 300 — 1000К. ТЬЬ ргосес$иге гешочеь -90% оГ йе оПКоиис!еос16е рпгпега ап6 деохуписсеос16еа апс! сап Ье гереасесс аа деаспЬе6 аЬоче со оЬсаш йгсЬег ршсйсасюп оЕ сЬе акр!сТсед РЬ$А. lлЕтобЕЕ2сЕеоп Ео РтоЕосо15 4-7 С!оп~пц РСК Ргос1ис1ь с сомтс Амвс!нвст ьгсмсссть от ОНА св!чсвлтю вч РСК8 шсо р!аътпЫ ог РЬа8ешЫ частота сигов оис со Ъе еаяег ааЫ йап с!опе.

Мапу ргот!исса оЕ РСК аге геса1сбгапс со с1опш8 Ъу сЬе иаиа1 шесЬот!ь Ьесаиае: ° 5ечега! оЕ сЬе соиипоп!у иаетс сЬеппоасаЫе Р)ъ)А ро!ушегазеа роааеаа а сешр1асе-!пс1ерепт)еис сегпипа! стаиьЕегаае асс!ч!су (ехсепссаае ас6лсу) йас геаи1са ш йе атЫ!с!оп оЕ а яп8!е, пира!гет1 пис1еосЫе ас сЬе 3' ептЬ оЕ ашр1!Етет) РХА Ега8шепса (С1аг)с 1988; Мо!е ес а!. 1989; Ни 1993).

ТЬе пис1еосЫе ас)6ет) Со сЬе 3' епс! тсерепт)а ЪоСЬ оп йе атс)асепС Ьаве апд оп йе раг6си!аг Р!ъ)А ро!угпегаье иаетс тсипп8 РСК (Ни 1993). Рот ехашр1е, ъчЬеп тЬе 3'-Сеггиша! Ьаье оЕ сЬе сетпр1асе Р)ъ)А !а сус!с)!пе, Тат) ро!ушегаае ъч!11 еЕ6степс1у сгапаЕег ап ат)еп!пе геяс!ие со сЬе епт! оЕ сЬе сошр1есетс сЬа!п (С1аг)с 1988; Ни 1993). ° Тат) ро1ушегаае апс1 ргеяииаЫу ойег сЬегшоасаЫе РЬСА ро1угпегаьеа ьигчтче ехсгас6оп ълсЬ РЬеиоЬсЫогоЕотгп, ейапо! ргес)рба6оп, аптс осЬег ге81шепа соиипоп1у ивет) со рипЕу йе ргойксь оЕ РСКа ЕСгоъче ес а1.

1991; Вагпев 1992). ТЬе соп6пшп8 ргеаепсе оЕ сЬе РХА ро1ушегаье со8ейег ълсЬ геятсиа1 с!ХТРа обеп сЬъчагса тпесЬотЬ со сат1ог сЬе епсЬ оЕ сЬе агпр!гбед Р!ъ)А Еог с1оптп8. Рог ехатпр1е, йе аигч!ч!п8 Р)ъ)А ро1ушегаае ъч!11 611 гесеааетс 3' сегпши сгеасетс Ьу т)!Веас!оп ъчЬЬ геаспс6оп епаушея С)птсоиЬсет11у, сЬ!а саггу-очес ехр1а!па !п 1аг8е рагс сЬе сВЕ6си16еь епсоипсегет1 Ъу тпапу 1аЪогасопез тп с1опш8 РСК ргоссисса айег т)!Ветс!оп ълсЬ геатт!ст!оп епхушеа. Очег йе уеагя шапу итесЬоба — аоше 8оот) апс) тюгпе Ьас! — Ьаче Ъееп т)еч!ает! со с!гсшпчепс сЬеае тс!ЕЕтси!ссеа (Еог гелеъч, р1еаае атее Ьеч!а 1995).

ТЬеае 1пс1итсе: ° !ухач сБе 3' — т5' ехопис1еахе астсчсту оЕ ЬассегсорЬаце Т4 Р)чА ро!утегаье ог РЕтт Р)ъ)А ро1ушегаве со ро1таЬ сЬе сепшпс оЕ РСК ргот)исса йас сопсаис ехсепт)ес) Ъааеа !Непа!еу ес а1. 1989). ТЬе ро11аЬет! Р)ъ)Аа сап йеп Ъе РЬоарЬогу!атет! Ьу Т4 ро!упис1еотгбе )стпаае аптс с1опетс !псо а Ыипс-епс)ет) с)ерЬоьрЬогу!асет! чессог. ° СЕотпд Ыипс-елтсетЕ ЭХА Егатттеиса депегасетЕ Ьу тЬегтоасаЫе РХА ро!угпегаьеь аисЬ аа Ръчо апс1 РЕи, ъчЬ!сЬ с)о пос ехЫЬтс сегиипа1 сгатсаЕегаае асичиу апсс Вепегасе Ыипс-епс)етс ргойкса (Нтпп!ат!ае1а ес а1. 199б). В!ипс-епс1 с!оп!п8 !а посог!оиа!у шеЕ6ссепс. Ечеп ти сЬе ргеаепсе оЕ !аг8е агпоипь оЕ ЪассепорЬа8е Т4 РЕ4А!т8аье, сЬе с!оп!и8 ейктепсу оЕ Ыипгептсегс РсчА та 10 — 100-Ео16 1оъчег йап сЬе еЕЕтссепссеа асса!пес) ъч!сЬ РХАа ет)и!Рретс ъчЬЬ соЬеяче сегиип).!п ат)тссс!оп, Ыипс-еитс 118асюп ргочЫеа ио оррогсипиу со сбгесс сЬе опеп- 1исгог(асс(оп го Ргососо6 4 — 7 8.31 сасюп оЕ сЬе агпрВЕсес) Егаупепс оЕ Р)чА ън(сЬ(п сЬе чессог.

Рог сЬезе геаюпз, Ыипс-епс!ес! с!оп!и8 оЕ РСК ргодиссз Ьаз Еа11еп 6от Еачог гп сЬе 1азс Ееън уеагз апг! Ьаз Ьееп 1аг8е1у гер1асес! Ъу тесЬос(з сЬас ге1у оп 68асюп оЕ соЬеяче епъ!з. ° (7зсщ а 1теагсгег1 р1азтсг1 чессогусссеИ ъч(с(с а ргосгиг1(пд 3' сЬута1у1асе гезЫие ас еасЬ оЕ Кз 3' сепп(п(. ТЬезе Т чессогз аге изес( со с1опе РХА Егауиепсз йас саггу а попсетр!асей, пира!гес( с(еохуас!епозу1 гез!Йие ас СЬегг 3' сегиип( (Но!соп апс( СгаЬапс 1991; Неп8еп 1995а).

А з!п81е пира!гед 3' сЬупийпе гезЫие гпау пос зеет 11(се пшсЬ оЕ а соЬеяче епй Ъис К ь епоиВЬ Со ргочЫе а Ягоп8 СоеЬоЫ Еог СЬе пира(гес( ас!еп!пе геябие оп РМАз атр!!Есеь! ги РСКз саса!угес1 Ьу Тад ог апу ойег сЬепиозсаЪ|е Р)ъ)А ро!утегазе сЬас асЫз 3' аг(епозу! онегЬапус С!оп!п8 !исо Т чессогз Ь герогсе<!!у 50 сипез тоге еЕ6с)епс сЬап Ыипс-епъ! с!оп(п8 оЕ атр1!Егег( РХА 6.ауиепсз (Но1соп апс! СгаЬат 1991; МагсЬи)ь ес а1. 1991). ТЫз !з а1июзс ес!иа1 со сЬе ейксепсу оЕ с!оп(п8 йас сап Ье асЬ1ечед ън!сЬ Р)ъ)Аз ъчЬозе 3' ргосгияопз аге а гиоге гезрессаЫе 1еп8сЬ. ° Аг1сЕ(п8 гезспс6оп з(гез го с(се 5' сегтт1 оЕ !Бе о!18опас1еос(г1ез изег( со ргипе РСК.