Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.2 (Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - 2001), страница 13

Сопйпп йе и!епйу оГ сЬе с1опес( Ггаашепса Ъу Г))ч)А аес)иепс!па, геппссюп шарр!пй, ог 5оийегп ЬуЬпйгасюп. Рго1осо! 6 С!оп~пц РСК Ргос1исЬ Ьу АсЫ~6оп о1 Кеь|пс6оп Я1еь 1о Йе Тегпип~ о1 АтрИ~ед 0МА л|ак ог онсотчттсгеотвк ихтмгак тткгтт |тч РСК аге ойеп дея8пед тч)тЬ геядсдоп я|ек ш йе|г 5' ге8|опк. 1п тиапу сакек, |Ье ятек аге дНегепт ш |Ье ттчо РПшегк. 1и |Ьгк саке, агпр!|6сатюп цепегатек а таг8ет уга8гпепт тчЬоке тептипт потч саггу петч гек|гкдоп ятек |Ьа| сап Ье оке|1 уог сбтесдопа1 с1ошп8 ш|о р1аяш|1 честогк !5сЬагГ е| а1. 1986; Каи6пап ап|1 Ечапк 1990).

ТЬе рип6ед уга8шепт апд |Ье чес|ог аге й8ектед |ч|й |Ье арргорпасе гектпс|юп епхугпек, 118а|ед тоцетЬег, апд тгапкГогшед ш|о Е. со6 (р!еаке кее Г|8иге 8-3). Еог уеагк, |Ь|к тпейод от' с1опш8 РСК ргодистк тчак Ьеке| тч!|Ь тесЬпка! й16си16ек. Рог|ипа|е1у, и|окт оу|Ьеке ргоЫешк Ьаче Ьееп ко!чед, Ьгтп8|п8 8геат ииргочегпеп|к ш Ьой |Ье еРдс!епсу ап|1 герго|1ис!Ь!1иу оу |Ье тесЬптт!ие, Но|чечег, Ьетчаге оу йе уо!1оъчшц р!|Ы!к. ° Мапу гек|псдоп епхушек Еат! |о с1еаче гесо8п!тюп кетртепсек 1осатед с1оке |о |Ье епдк от" Е|Ь)А уга8шептк, рагдси1аг1у йоке 8епегатед Ъу РСЕ (е.8., р1еаке кее Каи6папп апд Ечапк 1990; Еагпс1| 1992; )ии8 е| а!.

1993; КусЫЙ 1995; Хтшгпегшапп ет а!. 1998). ° ТЬе ргекепсе оу гектдиа! ро1угпегаке асдчиу апд дарк айег с1еача8е о1 |Ье РСК ргодис| Ъу гек|пс|юп епхуп|ек сап ге8епегате а Ыип|-епдед Р)чА. ° ТЬе ргекепсе ш йе геасдоп штхтиге от геядиа1 яп81е-ктгап|1ед ргипегк ог доиЫе-к|гапдед ргипег-йшегк тпау гедисе йе еубстепс с!еача8е оу тегш!иа! гек|пс|юп я|ек ш атпр1|6|ед Ет!чтА шо1еси1ек. 5о!идопк |о йеке ргоЫешк!)е !и |Ье дек18п оуйе о1|8опис1еоттде ргтшегк, йе сЬоке от гек|псдоп епхушек, апд, ак |1експЬед аЪоче, ш йе е!итипадоп оу ргииегк, дарк, ап|1 йеги|ок|аЫе Е|ХА ро!ушегаке гготп йе атпр116ед ргодис| Ьеуоге дтцектюп чд|Ь гек|Псдоп епхуше!к), Етктед Ъе1о|ч аге когпе Ье!Р6|1 Ь|птк тот дея8п)п8 ргипегк.

° 'тчЬегечег рокяЫе, дек|8п ргттпегк йа| сгеа|е а ййегеп| гектгтстюп я|е оп еасЬ епд от |Ье ашр!16ед Р)ч)А. Ебгес|юпа! с!оитпц сап йеп Ъе икед со а||асЬ йе уга8шепс со ап арргор6- а|е1у ргерагед р1аяиЫ. ° Мапу гек|пстюп епхутпек Гат! |о с!еаче гесо8ш|юп кет)иепсек 1оса|ед с)оке то йе епдк от ПЬ)А )га8гпептк, рагдси1аг!у |Ьоке 8епегатед Ьу РСК !е.8., р1еаке кее Стоике ап|1 Аиюгеке 1986; Но е| а!.

1990; !ип8 е| а!. 1990, 1993; Каи6пап ап|1 Ечапк 1990; Еагпс1| 1992; КусЫЙ 1995; Ъпппегшапп ес а!. 1998). ВЬегечег рокктЫе, ачо|д ик|п8 гек|псдоп еихушек кисЬ ак Я|и|1111, 8.37 В.ЗВ СЬартег 8: 1и И(го Аптр1тбса6оп о1 РХА Ьу РСЯ т)~ 4тч Нтпбй еецвепсе С 9 О Крп(еецпепсе 6' 5~ ф б- ептПИу Ьу РСП астдссннн 3' ссдтссинн5 5 нннддбстт 3'ННН~ ~ссттд б(деет чпбп НЯбЯ епб Крп) сстдс 3 С5' 5'дастт ЗД Е!СЕ)КЕ 8-3 С!оп|п РС(( Ргодисге Ь Адд!(!оп о! Пеетг!с(!оп 5!(ее 5а|1, ХЬа1, ХЬо1, апд №т1, тчЬ!СЬ аге 1гпотчп то с1еане гепшпа! апд аиЬсегш!па! гесорп!т!оп ятеа !пегбс!епт!у. ТЬе сата1о85 оу гпапу сопппегста1 аирр!тета от епхутпеа (е.ц., )н)етч Епц!апд Вю1аЪ5) сопта|п |п(отша(|оп аЪоит (Ье е66степсу оГ с!еача8е от (Ьеае ятеа Ъу геатпстюп епхугпеа (хее Аррепйх 4).

ТДтЬегечег ро33!Ь!е, ачоЫ иа!п8 геатпстюп епхутпеа (Ьат йар!ау 3(аг асбчпу. ° ТдтЬегечег ро55|Ые, ачоЫ и5|ПВ гехтпст|оп ятеа (Ьат аге )гпотчп то оссиг пашга11у ъпт|дп (Ье ашр1тбед ее8шепт от" РЬ)А. 1т ТЬе 1оса6оп апд гуре оу геатпс6оп ятех аге ип)спотчп, ите геетгк6оп епхутпеа (Ьат аге )тпоъчп то с1еаче (Ье рагбси!аг арес|еа от' Р)'тА чегу гаге1у.

° Рех|8п а "с!ашр" аег)иепсе ат йе ехтгетпе 5' епда от тЬе о!!Вопис!еот!де ргипега то Ьо1д торе(Ьег (Ье епда от' йе агпр!|6ед Р)н)А апд то ргочЫе ап адег)пате тоеЬоИ рог (Ье геагпстюп епхутпеа. Упуоггипаге!у, йеге !5 по аВгеешепт аЬоит йе тп|пипа! пшпЪег от" аг|СП(юпа1 Ъааеа гет!шгег| то яаЬ!1Рае йе тегпиш от" (Ье ашр!т6ег1 Р)4А. Еаг!у ехтппатеа гап8ед )гогп 4 ()ип8 ет а1. 1990) то 20 (Но ет а1. 1990) адд!т!опа! Ьааеа. Моге гесепт дата (Улпппеггпапп ет а1. 1998) аи88еег ТЬас тп гпоаг саает, оп1у 3 ат|С66опа1 Ъааеа аге гегригед тот ейктепт йВеяюп Ьу а ча6- есу от геяпсбоп епхутпеа.

РегЬара (Ье Ъехт адчке те то агЫ аа тпапу Ьааех аа геахоп апд Ъидеет ту|11 а!!отч со йе 5' епда оГ (Ье о!|8опис!еот|де рптпега, 5рес(()с РС(( рг)птега (гергеаептед Ьу агготне) аге дея8пед то аптрП(у а ге8)оп о( кпегеет тнПЬ (Ье деягед гесо8пйоп еег(иепсе (ог йе геетг(с(|оп епдопис|еаае (пс)идед ат йе 5' епд о( (Ье рпгпег. ТЬе хепее- 5(гапд рпгпег сопта|пе гЬе аепае 5(гапд о( а геатг|сбоп яте, апг! йе апт)аепее рпгпег сбита(пе йе соптр|егпептагу еег(иепсе о( а аесопд геетпсдоп яте. (А) То асЫече ЫВЬ е(Пс|епсу гПВеяюп, агЫЫопа| пис|ео(Ые5 гпиет Ье |пс|идет! оп Ьо(Ь 5Ыеа о( йе геатг|СПоп епдопис|еаае еег)иепсе.

|и (Ы5 ехагпр|е, ргорег гесо8п|тюп апг! си(Пп8 гег|вге5 ат |еаат йгее агЫ|допа| Ьаеее оп еПЬег яг|е о( (Ье Н)пгПП яте, апд ат |еая ттно агЫт6опа! пис|ео(Ыеа оп е|йег яг|е о! (Ье Крп| яте. (В) дптрПВсабоп Ьу РСР ргос|исее а ереойс ргодист ъий ап НтпгПП яте ат (Ье 5' епг| апд а Крп! яте ат йе 3' епг!. (С) О!Веатюп ипй Н|пд|П апд Крп| ргодисеа а РСП ргодист йат сап Ье с|опед д(тест(опаПу. Ртгосо! 6: С/оп/пи РСК Ргот/исгь ЬуАт/т/гг!оп и) Кеьгг/с!гоп 5оеь го йе Тегттт' и/Атр/фет/ Е)/т/А 6.39 МАТЕК1Асо СА!)Т/ОХт Р1еаье ьее Аррепг/!х 72 Еог арргорг!аге Ьапг/1/пд оЕ тасепа/ь тагЬет/ ъий <! >.

Вобегь апд Ьо1о6оп5 Р1еаье ьее Аррепгпх ! Еог соптропеп!ь оЕ ь!осЬ ьо/и!гоп, Ьи//егь, апг/ геаеепсь. Описе ьсос1т ьо1ибопь Ео ЕЬе арргорпаге сопсепсгаоопь. СЬ/огоуогт <! > /ОТА Г0.5 м, рН 8.0) Е!Ьапо/ РЬепо/тсЬ/огоуогт Л;7, и/и) <!> 5ог//ит асеса!е ГЗ м, рН 5.2) ТЕ ГРН 7.5) Епкугпеь апг1 Войегь Вас!егторЬаде Т4 Е)/Я/А !/еаье Кеьсг/с!/оп епг/опис/еаьеь Се!5 Адагоье 5е/ Р!еаяе яее 5сер 12. /х/ос!есс Ассг15 апд О17допос!ео11ь1е5 Рогггагг/ ритег /20 рм) и н,О апг/ Кеиегье рптег /20 рм) !и ньО 73еясди Еогтяагтс аит/ гетегяе ргипегя саггу/пь сЬе арргорпасе геяспесюи Ысея.

ТЬе 3' еит/ о! еасЬ рпптег яЬои16 Ье аи ехаес сотир1етиеис оЕ -15 соиьесипхе Ьаяея ас а яе/ессет/ яссе ш йе !агдас Ет/я/А. ТЬе 5' сегпииия оЕ еасЬ рптиег яегтея ая а е1атпр со ЬоЫ соцесЬег сЬе сегииш оЕ сЬе ашр11Етет/ Р!4А аит/ со ргочЫе а !апт/!пав яссе Еог йе геяспесюп ептупте. ТЬе с1агпр яЬои/д Ье 3 — 10 пис!еосЫея Еп !епцсЬ, ТЬе гиЫ- рог6оп оЕ йе рпптег соисатия сЬе гесоци ссюп асе Еог йе геяспе6оп еп тугие, еасЬ рпгиег яЬоиЫ йегеЕоге Ье 24 — 31 пие1еосЫея /и !епьсЬ аит/ соиса/п арргохииасе1у едиа! ишпЪегя оЕ сЬе Еоиг Ьаяея, тгссЬ а Ъа1аисет/ йяспЬш1оп оЕ б апт/ С геяЫиея апт/ а !осе ргореиасу со Еопп ясаЫе яесопт/агу ясгиешгея. Рог ЕигсЬег т/есат!я, р1еаяе яее сЬе шсгот/иесюп со сЬтя ргососо1 аптс йе шсготЬте6оп со сЬтя «Ьарсег !Вели оЕ О115опис!еосЫе Рпшегя Еог Ваые РОК).

О/!допит!еос/де рпптегя яуисЬея/гет/ оп ап аисоитасет/ Р74А яупйеятег сап цеиега11у Ье ыеа тп ясапт/агт/ РСР, и/с/таис ЬпсЬег рип6еа6оп. Тагце/ 73/я/А '3/ЕСГОГ5 Р/аьт/с/ ОНА с/еаиет/ иттЕЬ йе арргорг/асе геьспсИоп еплутеп) апг/ рис!утес/ Ьу де/ еlес!горЬогеспь 1ЙЬе 1/пеаг/тет/ р/аяша ЕтЬСА сагпея сотпра6ые септиш сЬас тап Ъе 1фасет/ со еаеЬ ойег, ые а//та1/пе РЬояРЬасаяе са тешоте сЬе 5'-РЬоярЬасе 5гоиря аит/ шрргеы яе!Е-11цасюи ГР1еаяе яее СЬарсег 1, Ргососо1 201. оресса! Ецоьрьпеп1 УУасег Ьа!Ь ргеье! Ео 76оС Яасег Ьа!Ь ргеьес го орИгпит сетрегагиге Еог йе геьсг/с!топ епг/опис/еаье г/цеьс/опь Р1еаяе яее 5сер 3.

АЕЫ Жопа! ВеадепЬ 5сер 7 оЕ ЕЬть рго!осо! гедшгеь йе геаКеп!и !/ь!ег/ ш Рго!осо! 7 оЕ !Ь/ь сЬар!ег. 5!ер 70 оЕ ЕЬ/ь рго!осо/ гедшгеь йе геадепсь !/ьсег/т СЬаргег 7, Ргососо! 25 ог 26 апг/ Ргогосо! 27. 5сер 7 7 оЕ с/Иь рго!осо! та у геди/ге йе геаееп!ь //ь!ег/ т Рго!осо/ 72 оЕ ЕЬ/и сЬаргег.

57ер 73 оЕ !Ь/и ргоСосо/ гедитгеь йе геаееп!ь !/ь!ег/ т СЬар/ег 72, Рго!осо! 6, ог СЬар!ег 6, Рго!осо/ 70. 8.40 С)гарсег 8с 1п 'ъггсго Агпр!с)сгассоп оЕ ЕЗУСА Ьу РСК МЕТНО0 1. ()ае Еогъчагд апс1 гечегае рг)теса деяцпед аа оис!шед сп сЬе Масегса!а аесс(оп оЕ сЬ)а ргососо! со аес ир апс1 сапу ош Еоиг сдепска! атр11Ессасюп геассюпа (50-р! чо1шпе) со атр!1Еу сЬе саг8ес Егаитепс (р1еаае аее Ргососо! 1). СопсЬ)пе йе Еоиг РС1Ь, ъчЬ(сЬ, 1п аддге8асе, аЬои!д сопгаш 200-500 п8 оЕ СЬе деягед апср116садоп ргодисС. 2.

1Е йе РСК пихтге сопгашх пюге СЬап опе ог Съчо Ъапда оЕ апср!с6ед Ес!ъ)А, рип(у йе Сагпес Егацтепс Ьу е!ессгорЬогеяа сЬгои8Ь!оъч спе!Нп8!Ке!!ш8 сетрегасиге ацагоае (р!еаае атее СЬарсег 5, Ргососо1 6). 1Е пос рип6ес1 Ьу ие! е1ессгорЬогеыя ргераге РСК-атр!с6ед 13!ъ)А Еог 1сда6оп Ьу ехсгасдоп ъч(сЬ рЬепоЬсЫогоЕопп апс( и1сга6!сгасюп сЬгоиаЬ а СепсПсоп-100 61сег (р!еаае аее Ргососо1 3). 131аао!че йе рип6ед ргодисс сп ТЕ (РН 75) ас а сопсепсгас(оп оЕ 25 !с8йп!. 3. 1п а геассюп ъо1шпе оЕ 20 р!, дсцеас -100 пц оЕ рипбед РСК ргодисс ъчссЬ 1.0-2.0 ип)са оЕ йе ге!ечапс геасПссюп епхуте(а). 1псиЬасе йе геассюпа Еог 1 Ьоиг ас сЬе ордпиип сетрегасше Еог д(аехсюп. 4.