Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.2 (Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - 2001), страница 9

Ки|ек Гог АккепъЫ|пц апг! Регуогпъ|пц РСКк Ве|оьч 'ь а Иг о1 ги|ек Гог аккегпЫ)пц апг) рег|оггп|пц РСКк. !очек))цагогк ънЬо илц Ье кегбпц ир РСКк гпгьг Ьане ап ипг)егкгапгПпц о1 гцеке ги|ек апг) ацгее го гоПоъч гЬепи ° Кеер со а пцпппит аП ггаГПс |и апд оиг оГ гЬе 1аЬогагогу агеа г)ек!цпа)ег) гог аккегпЫу оГ РСКк. ° ЪЪгеаг 8|очек ъчЬеп ъъог)ъ!пц |и гце агеа апг) сЬапце ГЬегп 1гег|иепг|у, Ыю Гасе так)ь апг1 Ьеаг) сарк го гег)исе сопгапмпагюп Погп 1аоа| к)ъ!и апг) Ьаг сецк. ° )н)а)ъе ир уоиг оъчп кег оГ геацепь апг) гПкрокаЫе |гегпк Ппс!игйпц РСК гибек, пбпега| оП, апг) ънах Ьеаъ)к). 'ъ) ке пеън ц!аккънаге, р)ак)!сънаге, апъ) р|реггек гцаГ Ьаче пог Ьееп ехрокег) го 0ХАк ! и гЬе !аЬогаго~у го ваПе Ти )гадис(|оп 8Л 7 ир апд а(оге хо| ииопя 5(оге Ьийегх апд епхугпеа |п япай а((г)иоь, |п а деядпа1ед аесйоп о( а (геелег |оса(- ес| пеаг (йе Яоън Ьоод. Оьсагд айг)ио(в ог геаяепь айег иае.

Хенег ихе РСК геаяеп(ь |ог о)Ьег ригрохеь. ° Ве(оге преп(пй гп)сго(ийе (иЬех соп(а)п(пд геайеп1а иаед |п РСКь, сеп(гйиде 1Ьегп ЬпеЯу (1() ъесопсЬ) |п (Ье гп(его(ийе |оса(ед гп 1Ье (агп)паг Яоъч Ьоод. ТЬь сеп(пйийа((оп дероа)(х 1Ье Яи(д в |Ье Ьаъе о( (Ье (иЬе апд гедисех (йе рохяЬ~Я(у о( соп(агп|па(юп о( й)очех ог р)ре($|пй ден(сех. ° Ргераге дйийопх о( 0ХА ивед ах (епър)а(ех |п РСК а1 уоиг оъъп |аЬога1огу ЬепсЬ апд (йе (айе оп|у аз гписЬ о(|Ье дйи((оп аъ пеедед |п1о 1Ье РСК агеа. ° А( 1Ье епд о((Ье РСК, до по( (айе |Ье гиЬсь соп(а)п)пй апърййед 0ХА )п(о 1Ье РСК агеа |па(еаг$, ореп Иъе 1иЬсь апг| сапу ои( рохгагпр)$((сайоп ргосехя|пй ат уоиг |а|юга(огу ЬепсЬ.

Оесоп1апъ|па1|оп ой 5о|и1|опа апд Егйи(ргпеп1 Соп(агп(па()пй ОХА сап Ье )васина(ед Ьу )ггад(а((пй сег(а)п геайепь (Ьийеь гп)пиа дМТРа апд Н О) ън(1Ь 0Н $)ЯЬ1 а1 254-пгп ъчаче)епд(Ь. 0Н $(ф| (опть д(гпега Ьеинееп аг$|асеп1 рупгпхйпе геядиех |п соп(агп)па1- )пй ОХАМ апд гепдегх 1Ьегп гпасяче аъ 1егпр)а(ех |и |Ье РСК. |ггагйайоп (200-300 гп)!сгпт (ог 5 — 20 пяпи1еа) ь гпоа( геадйу ассогпр|ьЬед |п 1гапх(исепг ъчЫ1е гп)его(ийе (иЬех их|ой а согпгпегс|айу ачайаЫе 0Н сгояя $)пйег (е.д., 51га(айпйег, 5иа(айепе).

дХТРх аге геаЬ(ап( (о 0Н, Ьи| Таг)ОХА ро|угпегахе 'ь пог. ТЬе аепа)йн- $(у о( рг)пъега |о 0Н 'ь чапаЫе апд ипргегйс|аЫе (Ои е1 а$. 1991). 0Н нтасйайоп сап а|гю Ье ихед 1о десоп1агп)па(е |йе ои(ег аидасех о( ъгпай р)есех о( ег(и)ргпеп( (гасйя р)реиеа, е(с). ННог|ь агеах, поппъе(ай)с хит(асею о( гп(сто(ийех, апд (Ьеппа! сус(егх сап Ье десоп(агп)па1ед чд1Ь ъчеа(ь гю|и(юпх о( ЫеасЬ (е.й., 1()А С|огох; Рппсе апд Апдпь 1992). Ргенеп1$пк Соп1агп|па1$оп ой Опе РСК Ьу 1Ье Ргодис1в ой Апо1Ьег Огас(! Х-8)усоху)йье сап Ье ихед 1о девггоу агпрййед 0МАх 1Ьа| аге ип)пгепт)опайу сагпед (топь опе РСК та апойъег (Ьопйо е1 а|.

1990; ТЬогп|оп е| а|. 1992; (ог ген)еъч, р(еаъе хее Наг()еу апд КаъЬ|сй~ап 1993). ТЬь епхугпе илй с|еане огас)$-д(усояд)с ЬопгЫп 0ХА |йа( соп(а)пх д(3 геа)диеа |псогрога(ед )п р|асе о( дТ тех)диея Ьш ъч|й по1 с еане КХА ог доиЫе-х(гапдед 0ХА 1Ьа1 соп(а)пв г0 ог дТ геядиех, гевресйче)у. ТЬе соп(агп|па1юп рго|гко| ь )п)йа1ед Ьу гоийпе|у хиЬх1$(и()пй д()ТР (ог дТТР |п РСК. ТЬЬ хиЬа($1и()оп Ьаъ $$$$)е еЯес| оп |йе хресйс)(у о(1Ье РСК ог 1Ье апа(уях о( РСК ргодис|я $4оънечег, 1Ье у|е|с| о| агпр))йед ргодис(х гпау Ье х()ЯЬ()у гедисед (Рета|од 1991).

Хечег(Ье)ехя ънЬеп аиЬаег)иепг ае(х о( РСКа аге Ьпейу 1геа(ег! ън)1Ь огас)$ Х-я(усоху(йье, соп(агп)па((пй 0(ъ(А соп(а)п(пц игао| геядиеа 'ь г|еъ|гоуед. ТЬе ихе о( ЙЗТР апд игасй Х-д)усоау)ахе (о гедисе соп(апъгпаг|оп 'ь гпох1 Ье(р(и( ънЬеп а ъгпай пигпЬег о( 0ХА (гайгпепь аге (о Ье агпр)(йед (гогп гпапу ЬипдгегЬ о( хаги р)ех, (ог ехагпр|е, аа рагс о( а (агйе йепейс хсгееп.

$4оъненег, й )а )го рог|ап| (о геайае 1Ьа( десоп(агп(па1)оп Ьу игасй Х-Я(усгьу(аае ь Ье)р(и) Ьи1 по( согпр|е(е|у ейестве (Х)едегЬаиаег е( а$. 1994): |1 хЬои)д |йеге(оге Ье ч)еъчед оп$у аъ а х)пй(е согпропеп( о( а пюге согпргеЬепяче ргойгагп 1о гпапайе апг! ргечеп1 соп1агп)пайоп. Рготосо1 1: ТЬе Ваять Ро1утегаяе СЬагп йеас1топ 8.21 ТЬегта! сус!ег ргоВгаттег( чч!ГЬ сГеь!тес( атрИ(са1(оп рготосо( !Е 1Ье 1Ьепиа! сус1ег Ь пот ецн!Ррет( тчиЬ а Ьеатет(1Ы, нье еиЬег пипега! от! ог рагаГ6п тчах то ргечепт ечарогатюп о( 1(он|я(6опт 1Ье геасИоп пихтиге т(иг|пв РСК. РагаЕ6и тчах иот оп1у ргечеп|я ечарога6оп, Ьш а!ьо тпатита!пь яерагавои Ьеттчееи соитроиепп (е.в., рптпег апт$1ептр!ате| ил||1 |Ье геас6оп пихтше Ь Ьеатет|.

ТЬЫ ьерагатюп ргечепть иопьрествс Ыпсвив оГ рптпеш т(иг(ив 1Ье шита1 РЬаье оГ 1Ье геастюи (р!еаье яее |Ье ти(оппабоп раис! оп НОТ 5ТАКТ РСК|. Адй6опа! Кеареп$5 51ер 4 оГ ГЬ!я рго1осо! тау гесГшге ГЬе геааеп1я 1(ь1есГ тп СЬар1ег 6, Рготосо1 70, апс((ог СЬартег 72, Рго1осо! 6. МЕТНО0 1. 1п а ь(еп!е 05-гп! т(сгоГиае 10Ье, атпр!16са11оп 1иЪе, ог 1Ье чье!1 оГ а ятеп1е ттсго(пег р1ате, ппх (п |Ье Го!1очч(па огт(ег: 10х ашр(тутсат(оп Ьийег 20 шм яо1ииоп оГ Гоиг т(ХТРь (РН 8.01 20 рм Еогтчагт1 рпгиег 20 РМ течегье ргипег | — 5 ни|та(р! |ЬеппояаЫе ОХА ро!утиегаяе Н,О тегпр1ате ОХА То1а!чо1игие ТЬе 1аЬ(е Ье1отч ргочЬ(ея ь(апс$агт$ геас6оп сопй((опя !ог РСК. КС! 11ХТРя Рпгпегя РХА ро!утпегаяе Тегпр!ате РХА 1.5 гпМ 50 тпМ 200 РМ 1 РМ 1 — 5 ишь 1 ра то! Ри ТЬе РН о( 1Ье геастюи Ьнйег яЛои!д Ъе 8.3 тчЬеп гиеаьигет$ ат 25'С.

Весаияе оГ 1Ье Ы8Ь тешрегатиге т(арент(епсе о(гве РКа оГ Тая, |Ье РН ойЬе геаспои тч|!! т(гор то -7 2 ат 72'С (боот( ет а|. 1966; Регвиюп ет а1. 19801. ТЬе апюипт оЕ тешр|ате 1|ХА гет|н|гет( чапеь ассотт$|пв то |Ье соптр!ехву оЕ тп ьетртепсе. 1и |Ье саяе оГ тиагитпа!1аи ОХА, ир то $.0 рв |я ыет$ рег геасвоп.

Тур|са1 антонио оЕ уеая, Ьастепа|, апт( р|аяпта ОХАЯ мед рег геасвоп аге 10 ив, 1 ив, аит$10 рв, геяресвче!у. ЕасЬ ье1 оГ РСКя гпип аЬятауь |пс|ис$е роь(1(че апт( педа1Ые соп1го1ь. Роявче соп1го(ь аге гетрлгет$1о июпаог 1Ье еГвс(епсу оГ 1Ье РСК, шЬегеая педа6че соп1го1ь аге тот|и(тес(то 11е|ес1 соптагп|павоп чч(1Ь ОХАь ГЬа1 сои!а|п |Ье 1агде1 ьет(попсе. 5реавс Ригиегя" Тегир|ате ОХАЯ Вуааит(ег ОХА Тагве1 ОХА' "вуьяяит(ег ОЫА т(оеь иот соитии тагвет ьет(иеисеь.

ь ь|юнЫ геьегиЫе |Ье тегир|а1е ОЫА |и а8 о|Ьег геьресья сигор(ех(ту, яхе, аит( соисеи1гатюи. ьуегп р(ате ОХА В 1Ье О ХА нит(ег техт. 'Тагвет ОХА сои!а|иь тве 1агвет ьеонеисе. |1 саи Ье а гесогиЫиаит ОХА с|оие, а рис!вид ОХА Егавгиеит, ог а яаитр|е о( веиоит|с ОХА. |1 ь|юиЫ Ье ат(т(ет| то|ве роь!тюе соитго| ат соисеитгатюиь ецнюа|еит то |вохе ехрестет| |и |Ье тегир|ате ОХА. 11 В ойеи иесеьяагу то ьет ир а яеиеь оЕ роь|вче соитгов сои|а|и|ив тйвегеит агиоиип о( 1агве1 ОХА храпи|ив тве аиюнит ргет(|ает( |и гве 1еитр|ате ОХА.

Аи арргорпате т($(нт(ои о( 1Ье тагве1 ьет|неисе хвои(8 Ье ргерагет( авеат( о( 1|тле |и аи агеа о! Еве |аЬога1огу д|вегеит !гоги гЬат льет( (Ог 1Ье ргерагавои оЕ ответ РС8 геавеи!я ТЫь ргесаитюи гет(нсея |ве пьат о( соитаги|иат|ив етрлргиеит аит$ р|аьвачаге |и 1Ье агеа о(1Ье |аЬ- ' огатогу ье1 ая|т(е Еог РСвь. 45реа|йс Рпитегь аге оввоиис|еооде ригиегь яреаук Гог |Ье ьевшеи1 оЕ тагвет ОХА. Роябче Сии|го1ь 1 2 Хевавче Сои1гов 3 4 5 и! 1и! 2.5 Р1 2.5 р! 1 — 2 ни|о 28 — ЗЗ р! 5 — $0 р! 50 р! 8.22 СЬаргег 8г Еп Сгтсго Аптр1тЕтсастоп оЕЕ)ХА Ьу РСЯ 1Е йе йеппа1 сус1ег га поС ВССе6 ччЬЬ а Ьеагет) !Ы, очег1ау йе геасСюп птсхгпгеа ипСЬ 1 т!гор (-50 р1) оЕ 11хЬс пипега! от) со ргечепс ечарога6оп оЕ сЬе аатпр!еа с)пппб гереасес1 сус1еа оЕ Ьеа6п6 апс) соо1)пц.

АИегпа6че1у, р1асе а Ъеат) оЕ счах Ысо сЬе спЪе )Е пяп8 а Ьос а!асс ргососо1. Р1асе сЬе спЪеа ог сЬе ппсго6сег р!асе ш йе сЬеппа1 сус1ег. Акр!1Еу СЬе пнс!ек асЫь пяп6 СЬе бепаСпга6оп, аппеа!ЫВ, апс) ро!уптепха6оп Сппеа апс) сепсрегаспгеа 1сяе6 Ье1очч. ТЬете с!шее аге тшсаЫе Гог 50-р! геасс)опт аяешЫед ш сЬ)п-нтаПед 0.5-тп1 снЬет апд спснЬасед тп сЬеппа! сус1егт т нсЬ ат сЬе Рег)ссп-61шег 9600 ог 9700, Мат!ее Сус1ег ГЕррепт)огЕ), апд РТС 100 ГМ) ПетеагсЬ). Типет апсс сегпрегатнтет гпау пеев со Ье ат)арсен со тшс ойет сурет оГ ет)шршепс апс) геасс!оп чо!ншеа Ро!угпеггаасшп тЬонЫ Ье саге)е6 онс Гог 1 пипнсе Сот счету 1000 Ьр оГ 1еп8й оГ йе сагу.с РХА. Моя сЬеппа! сус1егт Ьаче ап еп6 гонсше тп тчЫсЬ сЬе агпрЬПет1 таптр1ет аге )пснЬасет) ас 4 С нп61 сЬеу аге гетпочетс Ггогп сЬе гпасЬше.

5ашр1ет сап Ье 1е6 нчего)8Ьс ас тЬ)т сетпрегаснге, Ьнс тЬон16 Ъе аготет) СЬегеабег ат — 20'С. ттгссЬс!гатч а багор!е (5 — 10 р1) Егогп йе сеас геассюп ппхспге апс1 сЬе Еопг сои!го! геас6опз апт) апа1уке сЬесп Ьу е!ессгорЬогеяь сЬгопцЬ ап ацагоае ог ро1уасгу!агпЫе це1. Ве апге со гпс1нс1е Е)!ч)А псаг)сета оЕ ап арргорпасе яке. 5сат сЬе Ве! тчссЬ есЬ16)нпт ЪгогпЫе ог 5'т'ВК Со!6 Со чсапа1схе йе Е)!ч)А. А тнссеяунс аптр1т6сасгоп геасс!ои тЬон!6 усеИ а геас61у гбяЫе Р)4А Гга8шепс оГ йе ехрессет) яге. ТЬе Ыеппсу оГ йе Ьапд сап Ье сопуттшед Ъу РХА тет)непсш8 Гр!еаье атее СЬарсег 12, Ргососо1 6), 5онсЬегп ЬуЬпеПтасшп Гр!еаье все СЬарсег 6, Ргососо! 10), ап6)ог гетстссс1оп шарртп8.

!Е аП Ьат Попе ъчеП, !апет оГ йе Пе! сопсатшп8 ташр1еь оЕ сЬе стчо ройпче сои!го! т 1ТнЬез 1 ап6 2) апд йе сешр!асе Р)4А нпт)ег сетс ьЬон1т) сопсаш а ргопипепс Ьапб оЕ РЕПА оЕ йе арргорпасе тпо)есн!аг тче)8Ьс. ТЬ)т Ьапд тЬон16 Ье аЬтепс 6опт йе !апет сопсатпш8 ташр!ет оГ сЬе ие8а6че сопсго1т ГТнЬет 3 ап6 4). !Е, оп сЬе осЬег Ьапй аП ст пос нтеП, рсеаье тес ТаЫеь 8-4 апс) 8-5. 1Е пппега1 о11 и ах наес) со очег1ау сЬе геассюп (5сер 2), гепсоче йе о)1 Егопт йе аагпр1е Ьу ехсгас6оп ччсй 150 р1 оЕ сЫогоГопп.