Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.2 (Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - 2001), страница 6

ТЬе(г ччог)г В е)ецапс)у апд ргоид)у деьспЬед (и аисоЫоцгарйса! гпеспо(гь Ьу Топ1 Вгос(г (Вгос(г 1995а,Ь, )997). ТЬе ьиЬьег(иепс ппрас( о( "ех(гегпорЫ))с" сп)сгоогцап(ыпь оп йе Ь(о(есЬпо)оцу )пдиьггу В деьспЬед Ьу Мад(цап апг! Маггь (1997). (Керпп(ед, чд(Ь регпг)ьь)оп, (гогп Вгос(г 1995Ь.) гь со ша(ге ЕаиЬЕи1 сор!еь оЕ а цепе, ап епхуше илсЬ ргооЕгеад!пц Еипссюп Ь гес)и)гед, ччЬегеаь !Е сЬе цоа1 !ь со с1опе ап ашр116ед ргодисс, ап епхугпе сЬас цепегасеь Ыипс епдь шау Ъе оЕ адчапсаце.

С)пс!1 гесепс!у, йеье сЬокеь ойеп гпчо!чед согпргош!ье оп сЬе рагс оЕ сЬе (пчеьс!цасог. Носчечег, пихсигеь оЕ ссчо ог гпоге РЫА ро!ушегаьеь сап ь!цп!Егсапс)у шсгеаье уге!д апг1 епЬапсе ашр!г6садоп, рагдси1аг1у оЕ 1опцег сагцес РХАь (Вагпеь 1994; СЬепц ес а!. 1994; СоЬеп 1994). ТЬ!ь ипргочегпепс !ь ргеьишед со Ъе дие со йе сарасЬу оЕ опе епгуше со согпр!егпепс сЬе (паЫ!(су оЕ апойег со ехсепд а рпгпег (ЬгоицЬ росепда1 оЬьсгисдопь оп (Ье сегпр1асе ьсгапд. ТЬеье оЬьсгисдопь (пс1иде гец!опь оЕ ЫВЬ ьесопдагу ьсгисшге (ЕсЬегс апд Кип)ге! 1993), аЬаыс царь сЬас саппос Ъе Ьпдцед Ъу ро1угпегаьеь!асрдпц сегпппа1 сгапьЕегаье асдису (Ни 1993), апг1 пиьра!гед Ьаьеь йас саиье попргооЕгеад!пц ро1ушегаьеь со ьсаП апд д!ььос(асе Егогп йе ргипегиегпр1асе (Вагпеь 1994).

5ечега1 шапиЕасшгегь посч ье1! сос)гса(!ь оЕ сЬеппоьсаЫе ро!угпегаьеь йас а11осч деыгаЫе Ееасигеь со Ье аььегпЫед !п опе геасдоп пихсиге. Рог ехатр!е, сос1сса!1ь оЕ ТЬг апд Тад, ьо!с1 ипг1ег сЬе сгаде пагпе РуХАгуше (М) КеьеагсЬ 1пс ) ехЫЬ!с ЬгцЬ 6де!гсу Ьесаиье оЕ сЬе ргооЕгеад!пц Еипсдоп оЕ ТЬг апд сЬе ЫцЬ ейк!епсу йас !ь сЬагассепьск оЕ Таг). 5!пи!аг!у, а пихсиге оЕ Таг( апд РЕи ро1ушегаьеь ьо1д Ьу 5(гасацепе ( Таг(Р1иь 1опц РСК 5уьсеш) апд ВоеЬгшцег МаппЬеип (Ехрапс1 Еопц Тешр1асе РСК 5уьсегп) цепегасеь ЬгцЬ у(е1дь оЕ 1опц сагцесь (ир со 35 )гЬ).

8.8 СЬиртет 8: /п Стттго Атр!т)|гас|оп оГ РИА Ьу РСК ТЬе ептушаск ргорегс(ез апт( арр1ка6опь оГ йе Ъеас 1|по|чп оЕ йе сошшегс(а)!у ргот!исет( сЬетшоасаЫе Р)ч(А ро!угпегааев аге яипнпаг(гет( (и ТаЫе 8-1. Реса(!а оГ йе (ао1ас(оп апт! рЬуяса! ргорег6еь оЕ йе риттТтет! ептушеа и|ау Ье Еоипт! |п йе тпапу геч1еъча (Ег!(сЬ 1989; Се!Гапс1 ап|1 ЮЬ(те 1990; СЬа ап|1 ТЬ1!1у 1993; Ве) ап|1 МаЬЬиЬап1 1994; СоЬеп 1994; Рег!ег еС а!.

1996) ап|1 Ъоо)ть оп й|х сорк (!пп(т ес а!. 1990; СПГ6п ап|1 СПЕ6п 1994; РбебепЪасЬ ап|1 Рче)тт!ег 1995). !и ат!|11тюп, а аипппагу оЕ йе еггог гатеь Гог СЬегпюатаЫе-геяатапт РХА ро1ушегаьет тпау Ье Еоипт! ас Ьсср://!(асег(а.птчЕтс.поаа.8оч/ргососо!а/сат)-еггогяЬ|ш1. Ноъчечег, |п коше садбея сЬе оп1у тоигсе оЕ |псоппасюп (т |Ье шт(еЕас(8аЫу орстш(тск спасет(а! вирр!(ет( Ъу |Ье тпапи(ассигег. Ргоргатттттт!щ Ро!утттегаье С!та!л Кеас6ои5 РСК (а ап пегас|хе ргосеая сопяь6п8 оГ йтее е!ешепся т(епасигас(оп оГ йе сетпр!асе Ьу Ьеас, аппеа1(п8 оЕ сЬе о118опис1еос(т!е ргипегь со |Ье яп8!е-астап|(ет( тагес тет)иепсе(а), ап|1 ехсепаюп оГ сЬе аппеа1ет( рг(шега Ьу а сЬегшоясаЫе РХА ро1ушегаае.

° Реиатигаттои. РоиЫе-астап|(ет( РЫА сешр)асеа |1епасиге ас а сешрегасиге йас ь |1есегиипе|1 ш ран Ъу сЬе(г С+С сопсепс. ТЬе Ь)ВЬег сЬе ргоротсюп оГ С+С, |Ье Ь(8Ьег йе сеи|регасиге гет!и(гет! со терагасе сЬе астап|!а оЕ сешр1асе РХА. ТЬе 1опаег |Ье РХА гпо1еси!ея йе дгеасег тЬе типе гет(шгет( ас йе сЬоьеп т!епасигас(оп сешрегасиге со ьерагасе йе съчо хсгапт(а сошр!есе1у. 1Е сЬе сетирегасиге Гог т!епасигасюп |х соо 1отч ог (Е йе сипе га соо ьЬогс, оп1у АТ-ПсЬ ге81опа оЕ йе сегир1асе Р(ч)А чч(11 Ье |1епасигей реп йе се|прегасите (т гет(исет(!асег ш йе РСК сус!е, йе Сешр1ате Р)ч(А тч111 геаппеа1 (пто а Ги1!у па6че сопт((С(оп. 1п РСКь сага!утес( Ъу Тат/ Р!ч)А ро!ушегаье, т)епасигасюп 1а сагг(ет( оис ас 94-95'С, тчЬ(сЬ |х йе Ь(8Ьеат Сешрегатиге йат йе епхуп|е сап епт(иге Гог 30 ог |поте сус!еа |чИЬоит аиаташ(и8 ехсеаяче т(аша8е.

1п йе 6гат сус!е оГ РСК, т!епатигат(оп (а хо|пе6тпеь сагг(ет( онС Еог 5 ш(писеев со !псгеаье йе ргоЪаЬ(16у йас 1ои8 шо!ееи!еа оГ се|пр1асе РХА аге Ги11у т(епасигет). Но|течет, |п оиг ехреПепсе, сЬ|а ехсепт)ет( репой оЕ т!епасигасюп (х иппесеааагу Гог 1(пеаг РХА шо1еси1еь ап|1 гпау ьогпе6гиеь Ье т(е!есегюит (СиасаЕтоп ес а1. !993). Ътте гесопппепт( т(епасигасюп Еог 45 тесопт(а ас 94-95'С Гог гои6пе ашр!тТтсасюп оЕ 1|пеаг РЫА сешр!асет |чЬохе сопсепса оЕ С+С (а 559о ог!еья Н(аЬег сегпрегасцгеь гпау Ье гет)и(гет! со т!епасиге сетпр1асе апт(/ог саг8ес Рот сЬас ате ПсЬ |и С-|-С ()559о).

Р)ч)А ро1ушегахеь (ао!асет) 6ош АгсЬаеа аге тпоге Ьеас-со1егапс йап Тат/ апт! аге |ЬегеЕоге ргеГеггет) Гог ашр!~6сасюп оГ СС-гкЬ РЫАя ° Аппеа!титт оГргттегь то гетр!ате Р/т/А. ТЬе сетпрегасиге итет( Еог йе аппеа!!п8 яер (Т,) (а сПНса1. 1Е сЬе аппеа1ш8 сетпрегасиге (а соо Ь(иЬ, йе о11цопис!еос(т(е ргнпегт аппеа1 роог1у, (Е ас а11, со йе сешр!асе ап|1 йе у(е!|1 оГ ашр!|6ет! РГ4А (т чету )оъч. 1Е йе аппеа1!п8 сетпрегасше (а соо 1очч, поптрестТтс аппеа!ш8 оЕ рг(шегыпау о|сит, гети16п8 1и йе ашр116са6оп оЕ ипччапсет( ьеашепсь оГ РХА.

Аппеа!(п8 (а иаиа11у сагг(ет! оис 3-5'С 1оччег сЬап йе са!си!асе|1 тпе16пц сешрегасиге ас ччЬ(сЬ сЬе о!18опис!еос(т(е ргипегв т((таое!асе Ггош сЬе|г сешр1асея Мапу Гогиш1аа ехтас со т(есегш(пе сЬе сЬеогеска! ше1с!пц се|прегасиге, Ьис попе оЕ йеш аге ассыасе Еог о!18опис(еос(т(е рг(шега оГ а1! 1еп8сЬь апт! ьет)иепееа (р!еате атее Са!си1а6пд Мербп8 Тешрегасигеь оГ НуЬг(т(т Ъестчееп 0118опис1еос(т)е РПтпегт апт( ТЬе|г Таскает 5ет(иепсеа оп р.

8.15). 1с (т Ъеас со ор6ииге сЬе аппеа!(п8 сопг66опт Ъу регЕогш(п8 а аеПеь оЕ|Па1 РСКа ас сетпрегасигеь гап8(п8 Егош 2"С со 10'С Ъе1очч йе !отчет оЕсЬе ше!сшд сетпрегасигез са!си1асет( Еог |Ье стчо о1(аопис1еос(т!е ргнпегя А!сегпа6че! у, сЬе сЬегша1 сус1ег сап Ъе ргоцгапипет! со иае ргоВгеьяче1у !отчет аппеа1(пц сегпрегасигеь (и сопьеси6че ра!гт оГ сус!еа ("соисЬт)отчп" РСК; Роп ес а1. 1991).

1па|еат( оГ ьигчеу)па а чаПесу оЕ аппеа11пц соп- !пггог(исг(оп 8.9 г)!г!опя )п яерага|е РСКя, орг!т!галоп )я асЫечед Ьу ехроя)п8 а я(п8!е РСК со а яе|!иепба1 зепея оЕ аппеа1|п8 |е|прега|игея т яиссеяя|че сус!ея оЕ йе геас|юп. Рог тапу !пчеяг!Вагогз, гоисЬ<(очгп РСК Ьураяяея йе пее6 |о г!есегт!пе |Ье ор6пшгп аппеа!!п8 |етрега|иге Еог ечегу ра)г оЕ ргппегя ап6 ыьед |о оЬ|а!и ассерсаЫе у)е!дя оЕ ап|р1!Егес) ргог(исгя !п гоибпе РСК (Ре|егяоп апг! Трап !993; Коих 1995; Нес1|ег ап|1 Коих 199б; Коих апс1 Нес1|ег 1997; р1еаяе яее |Ье !п(оппа6оп рапе! оп ТО|3СНОО|о|о| РСК). ° Ехгеггз(оп оГо11допис1еог1|Ее рптегя ь сагпед ои| а| ог пеаг |Ье ор|ппа! |етрега|иге Гог Р)я)А яуп|Ьея!я сага!ухе|! Ьу |Ье йег|поя|аЫе ро1уп|егаяе, |чЬкЬ гп йе сазе оЕ Таг) РИА ро!утегаяе ь 72 — 78'С.

1п |Ье Вгяг |ъчо сус1ея, ехсепя!оп Егоп| опе рпгпег ргосеес(я Ъеуопд |Ье зес)иепсе со|пр1егпеп|агу |о |Ье Ь(пс(!п8 з(ге оЕ йе ойег ргппег. 1п йе пех| сус!е, йе Вгя| |по!еси1ея аге ргойисес( ч|Ьояе 1еп8|Ь ~я ег)иа1 |о йе яеВтепг оЕ РЬ)А де!т6|ед Ъу |Ье Ь!п|1- (п8 я|ез оГ |Ье ргппегя. Его|п йе йьс! сус1е опччагс), |Ь!я яе8тепг оЕ РЬ)А ь ап|р1|Вед Вео|пе|пса!1у, ячЬегеая 1оп8ег атр1!Егсабоп рго|1ись ассипш1а|е апйгпе6са1!у (Ми!1!з апс! Ра1оопа 1987). ТЬе ро1утепха|юп гасе оГ Тпг) ро1уп|егаяе Ь -2000 пис1ео|Ыея/пппше а| йе ор6|па1 |егпрега|ше (72-78"С) ап|! ая а ги!е оЕ |Ьип|Ь, ехгепя!оп ь сагпе|1 ои| Еог 1 пшш|е Еог ечегу 1000 Ър оЕ ргодисг.

Рог йе 1ая| сус1е оЕ РСК, тапу |пчея68асогя ияе ап ех|епяоп 6|пе |Ьа| Ь гЬгее |ипея 1оп8ег йап |п йе ргеч!оия сус!ея, оягепз)Ыу |о аПо|ч соп|р1е|юп оЕ а11 акр!!Егес( рго|(ись. Но|чечег, |и ош ехрепепсе, йе геяи1| оЕ йе РСК ь по| я!Впйкап|1у а1|еге|1 Ъу ип1|епп8 чч!|Ь 1Ье ех|епыоп |ппе !п |Ь|я ячау. ° )чигг|Ьег оГсус!ея. Ая 6!ясияяег) !п йе рапе1 оп РСК 1Н ТНЕОКУ (р. 8.12), |Ье пшпЪег оЕ сус1ея гег)и!гес) Еог атр1!Всаиоп череп|!я оп |Ье пшпЬег оЕ сор|ея оЕ |е|пр!асе РХА ргеяеп| а| йе Ъе8)пп!п8 оГ йе геас6оп апд йе ейк!епсу оЕ ргппег ех|епяоп апд ап|р!|Вса|юп. Опсе ея|аЪ!ЬЬе|1 т |Ье Веогпе|пс РЬазе, |Ье геас|юп ргосеесЬ ип61 опе оЕ йе сотропеп|я Ъесо|пея 1игибп8.

А| |Ьь ро!пг, |Ье у!е16 оГ ярес!Вс атр1|йса6оп ргос)исхя зЬои!д Ъе и|ах(- |па1, |чЬегеая попярес!Вс атр1!Егсаг!оп рго|1ис|я яЬои!6 Ье Ьаге1у г(егесгаЫе, !Е а| а11. ТЬь ь Вепега11у йе саяе аГ|ег -30 сус1ея !п РСКя сои|а!и!п8 -10я сор!ея оЕ |Ье гаг8ег яес)иепсе апг( Таг( РХА ро!уп|егаяе (еЕВс!епсу -0.7). А| !еая| 25 сус!ея аге гег)шгег! |о асЬ|ече ассер|аЫе 1ечеЬ оЕ агпр1|Есабоп оГ я!п81е-сору гаг8ег яе|!иепсея !п |папипа1!ап РЬ)А |е|пр1а|ея.

Ор(! опа! СогпропепГ8 оГ Ро!узпега8е С!та!и !яеасГ!оп8 А питЬег оЕ сояо!чепь апг) а|Ы!6чея Ьаче Ъееп героггег( |о гег)исе ипассер|аЫу Ь!8Ь 1ече1я оЕ тарпппп8 апс) |о |псгеаяе йе еЕЕ|с(епсу оЕ атр!|Вса|юп оЕ С+С-гкЬ гегпр1а|ея (Ро|пр апс( Мес)гапо 1991; Ь)ечч|оп апс) бгаЬат 1994; чагаг(ага) апг( 8Ыппег 1994). Сояо!чеп|я !пс!ис(е ГоггпатЫе (1.25 — 109о матч) (5аг)саг е| а1. 1990), г()гпе|Ьу!зи1Гох!6е (ир |о 159о ч!ч) (Воо)сяге!и ес а1. 1990), ап|1 81усего1 (1-1098 ч)ч) (1.и ап|1 Ь)е8ге 1993). А|ЫЬгчея |пс1ис)е |е|гап|е|Ьу1апипопппп сЫогЫе (Нип8 е| а1. 1990; СЬече| е| а!.

1995), рогаяя!ит 8!и|агпа|е (10-200 тМ), апппоптт яи!Гасе (5сЬоег|1!и е| а!. 1993), попюпк апс1 са6опк десег8епгя (ВасЬтапп е| а1. 1990; Роп|тя апг( Вег8 1991), ап|1 сег|а|п ая уе| ипЫеп66ед "5рес)Вспу ЕпЬапсегя" я|сЬ ая РегГес| Ма|сЬ Ро1утегаяе ЕпЬапсег (5|гага8епе) апд СС-Ме1| (СЬОЫТЕСН). Мапу оГ |Ьеяе а|ЫЬгчея ап|1 сояо1чепыпЫЪЬ РСК ччЬеп ияег) ас Ь)ВЬ сопсеп|га|юпя, апг( |Ье ор|ппшп сопсеп|га6оп пшп Ье г!егегт!пес) еп|р|пса11у Еог еасЬ со|пЪ|па|юп оЕ рптеь ап|1 |егпр!а|е РХА. Ка|Ьег йап геасЬ!п8 Гог йеяе епЬапсеь а| |Ье Вгя| я!8п оГ |гоиЫе, Ь Ь Еаг Ъепег !п оиг ч)еяч со ор6ппхе йе ге8и1аг сотропепь оЕ |Ье геас6оп, раг6си!а|1у йе сопсеп|га6опя оЕ МВ|' апг( К' юпя (Кга|чегх е| а1. 1989; Рае|1е1 ес а1.

1992). ТЬе опе ехсербоп |о й|я Вепега! ги1е сопсегпя йе |ье оЕ СС-Ме!|, ччЬкЬ ~п ош Ьапс!я оЕ|еп очегсо|пея ргоЫепь оГ 1о|ч-еЕЕ|с!епсу атр1|Всабоп чч!|Ь ипсоорега6че С+С-псЬ гегпр!а|ея. 8.10 .Й Я Н аа а й— Е о са о ас Д о й о ся а о Е а а с с а о а .с с ср 'х а с с с б аа с .„о о а аЯ о о О а Я о с аа а с .с о. о о ь аа ,,о а с са 0 гс Н с:о о аа о' гс < ~ о 31=. „=," о. о са а Н.о й О Е < Ц д с со ~ф аа с о о 4 сс а 1 Е~ д 'о о Я ;з Е 'оа о ~Е а Е '- а а Я сЕ а о о а е< МЕ а1 о с~ с Е .о :) о ам а Я с о „а .с Я о аа с 'О а о ° о я с Я 'с о а О о с а О .с Я < .с я.

'аа д аЯ -:Я Й о .Й о Е с Е Е са Д о Л н с~ я а .а' Е с Й' оп с Я Ф ,с о о ы "о о .с а "с сЕа Я аао Я о а а .с са О а до с 3 .с с .о о о а сЯ О о с а о аа6 Ей а осс ссс а а Е ~Е "о .Я ас а о. 'с -о о с о с .с с а ) ' а .с - о ) а о о 'о ! Ю ю аа Г О с' о а с Е О о а о 3 с с Е о с Е Ю О с Е Ю ~а М < М Е а % а. м а Н л о с < а \ Й Ф с ссъ а й са З о о З а а < о х~~ к > д х о сс < аа о .! С аа Г~ с о с ло ОН о о аа а~ Ю а 1 Ю 'о 'о 'о о о са а с о а Я аа Л о о а со с, о о со а о' с Я Я' о к о О М М о < о < о а.,с о'. Р. Е «с йъ х Я,с Я о а сс Н о ас са о о со ыа сс Н < о а сс аа х ас Х са а Э Ф Э Е ао < с д о с о Е Ф .с Н о с с о Ф й. < о с с Э Ф й. о СЬареее 8: 1п Ъ|еео Атр!феагюп о1 РХА Ьу РСР, 1ОЯюс1исйои 8.11 ф.