Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.2 (Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - 2001), страница 8

Р(о !пчегсеь( гереас яеь!иепсея ог яе1Г-сотар!егнепсагу яес(иепсея >3 Ьр (п 1епВГЬ яЬоиЫ Ье ргеяепс. 5еь(иепсея оЕ сЬЬ суре сепг( ьо Еопп Ьаьгрьп яспьссигея, ьчЬкЬ, К яаЫе игк(ег РСП сопйсюпя, сап еГЕессьчйу ргечепс сЬе оПВопис!ео(Ые !топь аппеа1ш8 со ьп саг8ес ЕЭС(А.

ТЬе 3' сегннпа1 яеь!иепсея оГ опе рппьег яЬои!П пос Ъе аЫе со Ъий со апу осе оп сЬе ойег рпгпег. Вегасе рпгпегя аге ргеяепс ас ЫВЬ сопсепсга6оп 1п РСП, ечеп ьчеа(с сошр!ешепсапсу Ьесьчееп сЬегп 1еасЬ со ЬуЬгЫ Гоппасюп апг( сЬе сопяеь(иенс яупйеая апс( агпр! сбсасюп оЕ рпшег йьпегя.! Е рппмг йпьегя Еопп еаг1у ш РСК, (Ьеу сап согпресе Гог Еьг4А ро1угпегаяе, рппьегя, апс( пис!еосЫея апьс яо сап яьрргеы агпрЬПсаПоп оЕ сЬе саг8еь Гь14А. Роппасюп оГ рппьег с((шегя сап Ье гег(осег( Ъу сагеЕи! ргипег дея8п, Ьу йе ые оГ Ьоь ясагс ог соиеЬь(оьчп РСП, апйог Ъу сЬе ияе оЕ яресьаПу Гоппи!асес1 Гь(4А ро!угпегаяея (е8., Апьр!ь6оЫ, Рег(с!и-Е!гпегу СсгЬеп пюге сЬап опе ргипег ра!г В ыед !п а яп81е РСК, сЬес1с сЬас попе оЕ йе 3' епь(я Паче г1еьессаЫе согп- р!еьпепсапсу со апу осЬег рпгпегя ш сЬе геасбоп.

Са!еи1асес( Т ча1иея оЕ шепьЪегя оЕ а рпшег раьг яЬои1д поь йбег Ьу >5 С. ТЬе Т,„о( сЬе ашр86еП ргоь(нес яЬои!д пос с(ьТГег !топь сЬе Т ча!иея оГ йе рпгпег раьгя Ьу >10'С. ТЫя ргорепу епяигея сЬас йе ашр1ьТьеь( ргос(исс ьчП! Ье е(6с(епь1у ь(епасигес( ь(иг(п8 еаеЬ сус(е оГ РСК. ТЬе пашге оЕ сЬе 3' епь( оГ ргнпегя Ь сгие(а1.

1Е рояя(Ые, сЬе 3' Ьаяе оЕ еасЬ ргнпег яЬоиЫ Ье 6 ог С. Носчечег, ргшьегя чАй а ....14(466 ог .....Е(Е(66 яеь(пенсе ас сЬеьг 3' сепшш аге пос гесошпьепь(еь( Ьесаые сЬе нпияиаПу ЬьВЬ Л6 оГ сЬе сегпнпа! 6С Ьаяея ргогпоьея сЬе Гоппа6оп оЕ Ьаьгрш ягнсстея апь( пьау Вепегасе ргипег йгпегя. ((яебь! яеь(иепеея пос сошр!епкпсагу ьо сЬе саг8ес Гь(4А аге еопнпоп1у агЫед со ьЬе 5' епь( оЕ сЬе ргипег.!и Вепега1, сЬе ргеяепсе оГ яисЬ яес(иепсея г(оея пос 68шбсапс1у айеес аппеаПп8 оЕ сЬе оПВопис!ео(Ые со Пя саг8ес ГЫ4А. ТЬеяе ас(йьюпа! яес(иепсея !пс1иь(е ЬассепорЬа8е ргогпосегя (Ка1п ес а1.

19911 апс( 6С с!апьря (ВЬеЕ6еЫ ес а!. 19891. КеяспсПоп ясея аге а ярес(а! саяе. Вегасе ьЬе еубсьепсу оЕ Ыеача8е оЕ геяспссюп ясея (оса(ос( ас сЬе 5' сегпнш оГ ЕьЫА пьо(еси!ея 6 роог, сЬе ргппег яЬоо16 Ье ехсепь(ег( Ьу ас 1еаяс йгее аПй6опа! пнс1еосЫея Ьеуопс( сЬе гесо8п1с!оп яеь(пенсе ос йе геяспссюп ептуьпе. Хеьч Вп81апь( Вю!аЬя* сага(о8 сопсаьня ьпГоппасюп оп сЬе еЕПьеьепсу ьч(сЬ ьчЬкЬ ййегепс геягксюп епсушея с!еаче янея пеаг йе сегпнпь оЕ Еь(4А шо!еси(ея. ГьерепсПп8 оп (Ье ригрояе оЕ (Ье ехрегипепс, (Ье р!асегпепь оГ рппнп8 ясея пьау Ье сопягаьпеП Ьу сЬе (оса- сюп оГ пшсасюпя, геяьпссюп ясея, еойп8 яеь!иепсея, пнсгояасеП(ьея, ог гья-асПп8 е(егпепп.

Ъ9Ьеп с(ея8шп8 рпгпегя !ог ые оп с(314А сегпр!асея, П Ь Ьеяс со ые ГогьчагП апь( гечегяе рпгпегя сЬас Ь!пс( со яеь(иепсея (п йГ- Гегепс ехопя. ТЬья аПоьчя ашр1ь6са6оп ргодисо бегьчеП Ггош суь(ь(А апг( сопсашьпасш8 Вепошк Е314А ьо Ье еаяПу сПяс!п8и!яЬес(. С9Ьеп а яЬогс яес(иепсе оГ анино асЫя Ьая Ьееп оЬьа(ььес( Ьу яеь(иепеш8 а рнг(Еьеь( ргосеьп, роо1я оГ с(е8епегасе о1ь8опис!еосЫея сопсашш8 аП рояяЫе сойп8 сопьЬьпапопя сап Ье ыеП со апьрПГу сЬе соггеяропйп8 Вепоиис ог ось(4А яеь(иепсея. Рог пюге ь(есаПя, р1еаяе яее Ргососо! 11 он МОРАС. Гпсгол(иеглои 8.15 ° Кефтпд С)ле !еп8Х)л аглИ/ог р!аеетепг оГ есле о!!копие!еог!глек ю СЬас сЬе 3 -сегпипа1 пис1еосЫе ь а б ог а С. СЬес)г сЬас сЬе пчо оПВопис!еосЫек с)о пос йкр!ау к!Вш6сапс согпр!егпепсапсу.

Ак а ги1е оГ сЬишЪ, по пюге сЬап сЬгее сопкесшпе пис1еосЫек оп опе ргипег кЬои16 Ъе сошр1ешепсагу со ГЬе осЬег ргипег. Сопсрм$ег-а8818(ес! Ое81дп оГ О[фопос!ей!с!е Рг!гпег8 То ачоЫ Ъогег!ош, каче шпе, апг( пнпипсхе ргоыепь, гье сошрисег рго8гапь со орсппсхе сЬе г)ек!Вп, ке!ессюп, апл! р!асешепс оГ оПВопис1еосЫе рпшегк. Мапу яапг1-а1опе сошршег рго8гапь сап Ье оЪса)пел! со кеагсЬ кел!иепсек Гог рппип8 ясек сЬас 6с а кес оГ икег-г!еГлпел! ракашесегк. 5исЬ рго8гапь 8епегасе а Ь!егагсЬу оГ росеп6аПу кресл6с ргппегк лчЬоке ше!сш8 сегпрегасигек Ьаче Ьееп са!си1асей ВепегаПу ияп8 сЬе пеагекс-пе!8ЬЪог шесЬой лп лчЬкЬ сЬе сЬегпюг(упапие яаЬсПсу оГ сЬе ргппег:сешр!асе л!ир1ех ь г1епчес! Ггогп сЬе япп оГ сЬе ксасРПп8 лпсегасСюпк оГ пе!ВЬЪог!п8 Ъакек (е.8., р1еаке кее Вгек1аиег еС а1.

!986; КусЫПс 1995; Олчсхаггу ес а1. 1997). Мокс оГ сЬе рго8гапь гье ВгарЫс соо1к, ешр1оу гьег-Гпеп61у !псег(асек, апс! гап)с росепба! ргипегк апг! рпгпег ралгк ассогйп8 со сЬе лче!ВЬс акк!Впег( со чапоик рагашесегк. 5оше оГ сЬе рго8гапь сопсалп, Гог ехагпр!е, Гасл1е кеагсЫп8 оГ г[асаЪакек Гог ип!псепсюпа! шассЬек со сЬе рпплег, орппиха6оп оГ сопй6опк Гог сЬе ашр!66сасюп геассюп, сгапк!асюп оГ апппо асЫ кег!иепсек лшо рори1апопк оГ г!ецепегасе о68опис1еосЫек, апл! е!пп!папоп оГ рпшегк сараЫе оГ Гогпип8 кСаЫе кесопс!агу кСгиссигек.

АП оГ СЬе рори1аг ГлЪ(А апа1укь рае)га8ек сои!а!и корЬь6- сагег! шог)и!ек Гог рпшег г(ек!Вп (р!еаке кее Аррепйх 11). Са!ссс!а6пе МеИ!щ Тегпрега1иге8 оГ НуЬгн[8 Ье(чмееп О[!Коппс!ео64[е Рг!спег8 апс! Т!се!г ТагцеС бес[оепсе8 5ечега1 ел)иас!опк аге ачал1аЫе со са!си!асе сЬе ше!Пп8 сегпрегасиге оГ ЬуЪг(й Гогшег! Ъеслчееп ап о68опис!еосЫе рплпег апг! Ьк сошр1ешепсагу саг8ес кел)иепсе. 5!псе попе оГ сЬеке аге регГесс, сЬе сЬоке Ъеслчееп сЬегп 1к 1аг8е1у а плассег оГ регкопа! ргеГегепсе. ТЬе ше1с!п8 сегпрегасигек оГ еасЬ гпеплЪег оГ а ргипег ра!г кЬои16 оЬчюгь!у Ье са!си1асег! ик!п8 сЬе каше ег)иалюп. ° Ап ешрлпса! апс! сопчешепс ел!иас!оп, )сполчп ак "ТЬе гЧаПасе ги!е" (5и88к ес а1.

1981; ТЬе)п апд ЮаПасе 1986), сап Ье окей со са1си!асе сЬе ше16п8 сешрегасиге Гог регГесс г)ир1ехек 15 — 20 пис!еосЫек !п 1еп8сЬ !и ко1чепск оГ Ь~ВЬ юпк ксгеп8сЬ (е.8., 1 м Ъ(аС1): Т (лп "С) = 2(АГТ) + 4(С+С) лчЬеге (А+Т) ь сЬе кшп оГ сЬе А апс! Т геяйлек !п сЬе оПВопис1еосЫе апл! (С+С) ь сЬе яип оГ С апс1 С гек!с1иек лп сЬе оПВопис!еосЫе. ° ТЬе ел!иас)оп Пепнеб ог!8!паПу Ъу Во!соп апл! МсСагсЬу (1962) апл!!асег шог66ел! Ьу Ва!йпо ес а1.

(1989) ргейсск геакопаЫу лчеП сЬе ше!Пп8 сешрегашге оГ о1л8опис1еосЫек, 14-70 пис!еоСЫек ш!епВСЬ, ш са6оп сопсепСгаСюпк оГ 0.4 Лчл ог 1екя Т (ш ОС) = 81.5ОС+ 16.6 (!о8ла[К !) + 0.41(со[С+С]) — (675/и) лчЬеге п ь сЬе пшпЪег оГ Ьакек !п сЬе оПВопие!еосЫе. ТЬлк ег)иас!оп сап а!ко Ье окей со са1- си1асе сЬе гпе!6п8 сегпрегашге оГ ап аплр!66ед ргог!исс лчЬоке кег)иепсе апг! к!хе аге ЬосЬ )гпочгп. 'лллЬеп РСК ашр1~6сас!оп !к сагпе6 оис ипг)ег ксапл!агг[ сопй6опк, сЬе са1си1асел! 8.1б СБаргег 8: 1п Ъг|гго Атр1фсайоп оГ РХА Ьу РСЯ гпе10пц гегпрегагиге оГ |Ье апър!1Ггег! ргос1исс кЬои!г! пог ехсеег! -85'С, ъчйсЬ ъч|11 епягге согпр1еге керагаггоп оГ гЫ кггапдк ъ!иг!пц гЬе г!епагигаг|оп кгер.

Хосе гЬаг гЬе г!епагигаг)оп гегпрегагпге еп РСК 1к гпоге ассигасе!у г!еГгпег) ак гЬе гегпрегагиге оГ |ггечегяЫе кггапг! керагаг)оп оГ а Ьопъоцепеоик рори1аВоп оГ гпо1еси!ек. ТЬе гегпрегагпге оГ гггечегяЫе кггапс) керагаЫоп ь кечега1 г)ецгеек ЫВЬег гЬап гЬе гпе!г)пц гегпрегагиге (гургсаПу, 92'С Гог 0ХА ънЬоке сопгепг оГ Ск-С |к 5096) (ЪЪгеггпиг 1991). Хопе оГ гЬе аЬоче ег!иаг)опк га)се |пго ассоипг гЬе ейесг оГ Ьаке кег!иепсе (ак оррокег! го Ьаке согпрояг|оп) оп гЬе гпе1г|пц гегпрегагиге оГ о!1цопис1еог)г)ек.

А пгоге ассигасе екгипаге оГ гпе1г|пц сепгрегагиге сап Ъе оЪга)пег! Ъу |псогрогабпц пеагекг-пе|цЬЬог гЬеггпоь!упагп|с г!ага гпго гЬе ег)иабопк (Вгек1аиег ег а1. 198б; Еге)ег ес а1. 198б; КусЫЙ ес а1. 1990; ЪЪгегпгиг 1991; гъусЫй 1994). Ноъчечег, гце ЪЪга11асе ги!е апг! )Ье Ва!йпо а1цоП)Ьгп аге Гаг кппр1ег го арр1у апъ) аге регГесс1у аъ!еъ)иаге Гог гиок! ригрокек. СОРТАМ!ХАТ!О|Ч !Х РСК А ргоЫет согпвоп|у епсоип)егег| |п РСК 'ь сопгагп!паг!оп ик|гЬ ехоцепогь 0ХА кес)иепсек гЬаГ сап Ье агпрППег) Ьу гЬе оццопис!еог!г)е рг!тегк.

|и ечегу саке, гць сопгав!паг!оп 'ь ГЬе Гаи|г о1 к|орру ъног)ъ Ьу )пчекг!цагогк ог гЬе|г соПеациек, ънЬо !паг)чепепг!у 'вггог1исе рогепг|а| гагцег кег)иепсек !пго ег|и!рвепг, ю1ибопк, апг) епаутек икед |и РСК. ТЬе Пгкг яцп оГ ггоиЫе 'ь цепегацу гЬе арреагапсе ог ап атрППсаг!оп ргог)исГ |и гЬе пецагЫе сопгго|к гЬаг !ас)ъ гегпр|аге 0ХА. Ргогп гЬаг гпогпепг оп, аП агпрППег) ргог)исгк об)апас) 'в гЬе геасгюпк сои)а!и!пц гекг 0ХАк викг Ье гецагг|ег| ак юкресГ. |и оиг ехрег|епсе, Пй!е 'ь ца|пег| )п кеагсЫпц Гог гце коигсе|к) оГ гце соп)агпвабоп.

!пк)еаг), П 'ь япър|ег, |екк ехрепкке, апг) |екк г)!кгирг!че Гог ац сопсегпег) Го г|ьсап! аП ю1ибопк апг| геацеп)к апг) ад дьрокаЫек, Го г)есопъагп!па)е |пк)гигпеп66 апг| Го )а|ге к)ерк юсЬ ак гЬоке г)ексг!Ьес$ Ье|оьч го гег|исе гЬе г)к)ъ оГ сопгап и!паг)оп |и )Ье !и)иге. |.аЬога1огу црасе |и ап !г)еа! нъог)г), РСКк июи!г) Ье аккепгЫед |и а керагаге |аЬогагогу гцаг Ьак |ь оънп кег оГ ег|артепг апг) 6 еегегк Гог кгоппц Ьийегк апг| епхугпек.

А пъоге ргаобса| а|гегпагЫе 1ог пъокг !очек)!цагогк, Ьоъненег, !к го г)ек!цпаге а рап!си!аг кесбоп оГ гце !абогагогу 1ог кегцпц ир РСКк. ТЬе аккегпЫу оГ РСКк 'ь Ьекг сагпег) оиг !и а |агп|паг Поъч Ьоог| ег)и!рреь) ънйЬ 1Л' ПВЬгк. ТЬеке ПВЬгк кЬои|г! Ье гигпег) оп ънЬепечег гце Ьогм! ь гюг |и ике. Кеер !п гце Ьоог1 а в!его)ице, 6!крокаЫе ц|очек, киррцек, апг) кегк о1 р!реи)пц г)ен!сок избег) го Ьапг)!е оп|у геацепгк Гог РСК. Весаъье ГЬе Ьаггец оГ аи)оваг!с р)реп!пц г)еч)сек аге согппъоп юигсек оГ сопгагп|пагюп, роягяеицкр|асегпепг р|реггек ецаррег! ън!)Ь г)!крокаЫе г|рк апг| р|ипцегк кЬои!г) Ье икег) со ргераге апг) Ьапгце геацепгк.

А|гегпабне|у, ике ргер!иццег), кгеп|е, г)!крокаЫе р|репе Прк (е.ц., Аеггьо| Кек!кгапг Т|рк, КекеагсЬ Ргог)исгк |пгегпабопа|) оп аигогпаг|с а!г-гцкр!асегпепг р!реп!пц г)ен!сек. 0ьрокаЫе |гегпк юсЬ ак р!репе г|рк апг| гиЬек к|юи|г| Ье икег) гПгесг!у 6огп гЬе гпапи)асгигег'к рас)ъац!пц апг) кЬои!г) пог Ье аыос|ачег| Ье1оге ике. ТЬеггпа| сус|егк к|ъои!г) Ье |осагег| |п а керагаге агеа ойЬе |аЬогасогу, ъчеП керагагег) 6опь гце Ьоод икег) 1ог аккегпЫу оГ РСК апг) Гог ргерагааоп о1 геацепЬ.