Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.2 (Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - 2001), страница 10

ТЬе ацнеоы РЬате, тчЬ)сЬ сноса)иь сЬе ашр66е6 Р)4А, тчП! Гогш а штсеПе пеаг сЬе шепЬсы. ТЬе писеПе сап Ъе сгаптсеттет) со а ЕгетЬ снЬе тчссЬ ап ашогпа6с писгорсрессе. Рог тпапу рнгрозеь, е.8., рнпбсас!оп оГ йе акр!тТтед Р)4А няп8 а Сепспсоп писгосопсепсгасог ог с)оп!п8 ашр!тбса6оп ргобнсся 6 Ь деягаЫе со гепюче тЬе оП Егопт сЬе ташр!е ЬеЕоге ргосее6)п8. .8т !МРОССТА)т)Т Ро пос аггегпрС сЫоготогпт ехггасг)опь )п гп1сгоСПег р!агея ТЬе р!асс)с наес$ ео СЬеае р1аСеа )а пог геатяапС Со ог8ап)с ао!чепгя ОР 11М!УАТ!О!х! Ог РСее5 'ччгЬеп кенш8 пр РСКЕ Гог Гсгхс 1ппе чч!й певуч 1егпр1асе РХА, песч рг!псега, ог а песч ргерагаЬоп оГ сЬегпсохсаЫе Г)ХА ро1успегахе епгугп, апср1~6сас!оп сч!11 8епега1!у Ье 1еаа сЬап ор6- гпа1. Р!пе спшп8 оГ ЕЬе геас6оп !х пепа11у гес)шгед со апрргеха попхрес!Г)с апср111)сас)оп апс)аког Со епЬапсе 1Ье у!е!6 оГ 1Ье с)ех!гес) Г)ХА ргодпсг.

ТаЫе 8-4 1!ЕСЕ хогне сопипоп1у оЪаегчес1 ргоЫепса апс1 ки88ехсх ччаух 1п счЬ)сЬ йе геас6оп сап Ъе орсппегей ТАВЕЕ 8-4 ТгоиЫеаЬоо1!п8 Ашр)111саг!опа 8ОССЕ5ТЕО ЙЕМЕОУ Ехгсхххтсох раоасем 1пеГВс!епс рпшгп8 ог шеГВс)епс ехсепяоп. 1пс!вбе ОС-Ме11 ГС1.ОХТЕСН) ш 1Ье геасбоп пнх1нге С)ае йе пнпнгини роаяЫе сешрега1иге авива 1Ье аписа! )п8 яер. Сопх)8ег адсКпц ад!вчапса ансЬ ах 85А !0.2 — 0.6 ш8/ш1), РМ5О (5ча), ог 8!усего! !55а) со сЬе геассюп инхшге. Рсгсу се пр1асе РХА. ВапсЬ сп 1Ье пеаабче сои!го!ь.

Сопсапнпас!оп оГ ао1в6опа ог р!аас1счгаге тлсЬ сешр!асс РХА. Р!еахе аее йе рапе) оп СОХТАМ!ХА- Т1ОХ ЕХ РСК 11псгоднсбоп) апд 1Ьеп гпа)се нр песч геа8епся Ресгеаае 1Ье аписа!)п8 6псе ап6)ог гпсгеаае 1Ье аппеа1ш8 сешрега1нге. РЬсспсс Ьапб)а) оГ сЬе счгоп8 пю1еси1аг сче)КЬ1. ХопхресгВс ргнп! п8 Ьу опе ог ЬосЬ рпгпегх.

А Вепега!!ге6 япеаг оГ ашр118е6 РХА 1Ьас пгау оЬасиге сЬе аеа!ге6 ргодвсс. Агпр116са6оп оГ рпшег гВшегя Тоо пшсЬ сешр!асс РХА. ВапсЬ оГ 1Ье сешеа!гед ргос1всс аге хЬагр Ъш чегу Гашс сп Ъой роя6че сопего!а апг! Сеаг РСК. ВапсЬ оГ сЬе дех!гед ргодвсс япеаг шсо йе рогбов оГ йе Ве! сои!а)псп8 1осчег-шо1есв1аг-сче)КЬс РХАя ВапсЬ оГ йе с$еягед ргодисг аге чеку Гаси! !и СЬе сехС хапср1е апд сп роа1сгче сопсго! 2. ТЬе Ьапд )и роябче сопсго! 1 Ь пшсЬ ягои8ег. Ргогосо! 1: ТБе Ваясро!утегаге СЬат йеасс!оп 8.23 5ес ир а аепеа оГ РСКа сопсашгп8 6сТГегепс сопсеисгабопа оГ сЬе ьчо рпгпегя Р!и6 сЬе орсииа! сопсепсга6оп апд сЬев хес вр а аепеа оГ сонсЬс1осчп РСВА спаса!и!п8 сИГегевг сопсепггасюпа оГ МВг' Со Впд йе ор6ша1 сопсеп1гасюв. Кернпуу сЬе сепср!асе РХА Ьу ехсгасбоп Гссч!се) сч!1Ь РЬепоЬсЫогосопв апд есЬапо! ргессрнасюп.

Р!ахо!че йе рвг!Вед РХА ш Н,О !по ЕРТА). СЬес1с сЬас пессЬег рпгпег Ьаа Ьоисо1о8у ъчссЬ ЬгВЫу гере6пче асс)невеса ги 1Ье сеиг- р)асс РХА. Орйшге 1Ье сопсепсгапопх оГ еасЬ рпгпег !идерепдепбу. Рхе сонсЬ6осчп РСК ав6)ог Ьо1 яап РСК Гр!еаае аее 1Ье шуоппабоп ране!1). Кебнсе 1Ье аиюнпс оГ сеиср!асе РХА Ъу Гас!оса оГ 2.5 ап6 10. ТКОБВ1.ЕБНООТПЧС МАЗОК РКОВ1.ЕМо ТНАТ ОССЕЗК ПЧ РСКВ ТаЫе 8-5 йеасНЬех ргоЫепсх СЬас |пау Ъе епсоиисегес) Гп апср11ТссаС)оп геассюпх апс1 ргоч)с)еа кп)с)апсе Еог Ьочч со ас)с)ге55 гпа)ог с)1Тйсси111ех.

ТАВЕЕ 8-5 ТгопЫеаЬоойпй РСК5 РО551В|Е КЕМЕО1Е5 Ечм атом РО551В|е СА05е5 5пЬорсипа1 аписа))пй сопсййопх. 5пЬорсппа! ехсепяоп оЕ аписа!ей ргппегя !псгеаае СЬе Сапе ог сеп|регаСше оГ г)епагпгаг)оп. 1пейесбче йепасигас1оп. Ртйапсе Ье1|чееп рг)шегх соо !агйе. 1Ле ргерага6опа оЕ СЬеппоасаЫе ро1ушегахеа сараЫе оЕ агпрИуспа 1опй аейшепса оЕ Р)4А. Мп!6р!е агпрййсайоп ргойисся 1Ле соисЬ|сосчп РСК, ргеуегаЫу си соп|Ь|пайоп |чиЬ Ьос яагс ог Ьоояег РСК. 1Е сЬе ргоЫеги регяаса, с)еяЕп апй аупйеяхе пе|ч рпшегх, раушй рагйсп!аг аиепсюп со |Ье хес)иепсеа оЕ сЬе 3' епйа. Ехсехяче аиюппь оЕ рг)шег-йсшега. 8.24 СЬарсет Вс Гп )гссто Атр!1)|гас!оп оу РГ|ЕА Ьу РСй Аи|р1)йсас1оп |чеаЬ ог попссесессаЫе. РеЕесбче геайепсГх); йеуесйче сЬеггпа1 сус1ег; ргойгашпипа еггог.

Со|праге сЬе у)е16ь оЬ|а!пес) йоги Гге|Ь апг) оИ геаЕепь ш РСК| |псиЬасе|! ш сччо сййегепс сЬеппа! сус!ега. Кеса1сп1асе Т оГ рпгиегь. 1Ле сопсЬйоюп РСК, ргеГегаЫу ш согиЬ|па6оп |чйЬ Ьо| яаг1 РСК. 'стет)Гу |Ье сопсеп1 гайоп оГ ргипега апй й песеыагу, орйгпае йесг сопсепсгасюп.

1Г сЬе рп|пега арреаг 1о Ье сЬе сап|с оЕ |Ье ргоЫесп, йеа)Еп апй аупсЬеяхе пеъч рпшега. Орсип|хе сЬе сопсепсгабоп оГ МЕС1 сешр!асе Р)4А, аисс Й)4ТРа. Те|с а тапсе оГ РН ча)пех си йе РСК. Сопядег гер1ас- спй Тгыч|й спс|пе, Ь|сше, ог Ерра |чЬкЬ Ьаче а 1о|чег сегпрегаспге соейк|епс 1Ьап Тпа (СЬепй ес ас. 1994). !Ле а Еге|Ь ргерагасюп оЕ сЬегшохсаЫе Р)4А ро1у- шегаае.

КерипГу сйе сеп|рсасе Р)4А со гешоче шЬГЪ|сога. 1псгеаае |Ье пшпЬег оГ сус1еа ас сои|сап| аписа!)иЕ Сеспрега|пге !55'С). !Г ргоЫеша регия, ас)6 ап епЬапсег (е8., 1095 РМЕО, 595 РЕО 6000, ог 109|а 81усего1). 1Е ргоЫепь 5181 регяас, есгйет геап|РИу а 1:100 ййис)оп оЕ сЬе РСК Ги Еге|Ь РСК Ьпйег апй ргипега Еог 30 сус1еа а1 а сопасапс аппеа! шй сеп\рега1иге от саггу ош пес|ей РСК. Рае ОС-Ме!с (СЕОНТЕСН) )и сЬе геасйоп инхп|ге. Рае сопсЬйосчп РСК, ргеГегаЫу ш согпЬ)пайоп |ч1й Ьос яагс ог Ьооасег РСК.

Орйш|хе йе сопсепсга6оп оГ МЕС!и сешр1асе РХА, сЬегшоасаЫе РЫА ро)ушегаае, апсс 6ЫТРа. Таас а гапае оГ РН ча!иес. Есгает геагпрИу а 1:100 сИис|оп оГ сЬе РСК |п ЕгеьЬ РСК ЬийЕг апсс ргипега Еог 30 сус1еа ас а сои|сап| аписа!)пЕ 1еп|регасиге 155'С) от саггу оцс пес!ей РСК от гесочег йе деягесс Ьапд оГ Р)4А Ггоп| а Ее! апс) геашрИу. Стет)уу |Ье сопсепсга6оп оГ ргсшегх апй й песемагу, ор6ш|ае сЬеи сопсепсгасюп. й йе ргоЫесп регяься деяЕп апй аупсЬеяхе пе|ч ргипегх.

8.2б СЬаргег 8: 1п (г(гго Атр!фсаг(оп оу' РХА Ьу РСй Нос!е1с АС1415 апд О!коппс!еоЕЫе6 Атр)ЕЕ|ее( РА(А пот ро(утегаье сЬат геассуопь прес!а! Е41о1репеп1 РАЕА ригебсапоп геял Орнопа1, р!еаае аее по|с го 5|ер 6. ЯаЕег Ьай ргезеЕ Го 75"С МЕТНО0 1. Роо! ир Ео е|8Ы РСКь (400 !|1) соп!а(пшц 1 !|8 оЕ йе г(еыгег( ашр!!ЕгсаЕ!оп ргог(исг. !Е потрес!Е|с ап|р!!6саноп ргодпсга аге ргеьепг аг а!8п!у|сап! !ече!| (е,8„аге |ЕегесгаЫе Ьу ае! е!есггорЬогеяа), рипЕу |Ье |Ееягег! Рго|!псс Ьу е1есггорЬоге|6 ЕЬ|ои8Ь !о|ч-ше!г!п8-гешрегагнге ааагоье Ьеуоге ргосеероп8 (р!еаье аее СЬар|ег 5, Рго|осо! б).

!Е пнпега1 о|1 |чая иаед го ргечепг ечаро|аиоо |!нг!па РС6, сепгг!Енсе йе роо!е|! аап|р!е| Ьпе6у апг! Егапкуег |Ье!о|нег (а|!неона) РЬазе |о а ЕгеьЬ пнсгой8е |нЬе. 2. Аг(с( 0.2 но!шпе оЕ 5х ргосе!паае К Ъийег апс( ргоге!паае К Ео а 6па1 сопсепЕгапоп оЕ 50 (|8/ш!.

1псиЪасе ЕЬе пнхгиге Еог 60 ш!пигеа а! 57'С. 3. !пас!(чаЕе !Ье ргоЕе!паае К Ьу ЬеаЕ!пц ЕЬе геасЕюп них!иге со 75"С Еог 20 пнпиЕея 4. Ехсгас! !Ье геаспоп пнхгиге опсе |ч!ЕЬ РЬепоЬсЫого!опп апс( опсе чч!ЕЬ сЫогоЕопп. 5. А<И 0.2 чо1шпе оЕ 10 м апнпошшп асеЕасе апс( 2.5 чо!ишеа оЕ еЕЬапо1. М!х !Ье ао1иЕ!оп ч|еЦ ап|1 а!оге Ь Еог 30 пипи!еь а! 4"С. |ЕЬ!Тря сагг!е|! очег Егоп| йе РС6 аге го!иЫе !и е|Ьапобс ао1ш!апа оЕ апнпошшп асс|а!с апг! чб!1 пог ргес!Рааге ч|!гЬ йе г!еягег! Рго|(исг (О!сауаша ап|! Вега !983). 6.

йесочег ЕЬе ргес!р!!а!ее( РХА Ьу сепспйдапоп аг шахнпшп ареег( Еог 5 гп!писеа а! 4"С |и а ш|сгоуи8е, Р!асагг( !Ье аирегпа!ап! ап|1 йеп тчааЬ ЕЬе ре1!е! чч!й 7096 еЕЬапо1. СепЕН6лце ЕЬе ао!ипоп а8а!и, гегпоче ЕЬе аирегпа!апЕ, апс( ЕЬеп а11оъч !Ье ре1!е! оЕ РХА Ео г(гу ш йе а|г. ТЬе РЬ!А гпау Ье Еигйег риг!Е|е|! Ьу сЬ|ошасо8гарЬу оп геяпышсЬ а| ЧЧ!гагг! РСК Ргерь Рш!6саноп буыеш (Ргошеаа) ог Е3!Аг!и!с!с Я!ааеп) ог Ьу 8е! е!есггорЬоге|Ь. ТЬЬ яер 6 гесогп|пепг!е|Е |чЬеп рг!шегь Ла| е Ьееп иьег! |о а|Ы геагпсноп яге| |о |Ье еп|!а оЕ |Ье ашр!!Е|ег! !ЗА.

13пыег! Рг!шегв ап|! РпшегппшегыЬон!д Ье гешочег! Ьеуоге Жалея!пц йе РХА |чЛЬ |Ье арргорпа|е ге|гг!сг!оп епаугпее (р!еаье атее Ргогосо1 3). 7. Р!аао!че йе ре1!е! |и ТЕ (РН 8 О). Аааише йа! !Ье гесонегу оЕ ашр!|6е6 РХА !а 50-809 Ь апг( йаао1че йе РЫА !п ТЕ (РН 8.0) ас ап еянпаге|1 сопсепггаЕюп оЕ 25 !|8(ш! (25 ифли). 8. Апа1уге -25 па оЕ йе риг!Егег( РХА Ьу ацагоае-е!ЬЫннп ЬгошЫе 8е1 е!ессгорЬогеяя ияп8 шаг)сега оЕ ап арргорпаЕе ыке. СЬес1| !Ьа! ЕЬе ашр11Еге|! Ьапс( йиогеасеа чч!ЕЬ йе !псепа!!у ехресгес( оЕ -25 пц оЕ РХА.!Е песеааагу, ас()ия йе еянпаге оЕЕЬе сопсеп!гапон о( йе рип'- Егег( РХА. Рго1осо! 3 Кегпоча! от О!~допрос!ео6деь апд Ехсеьь дМТРь тгогп Атрй~ед 0МА Оу И1га611гайоп т нези лаг чеач соогг кгАзомз то агмоче очизгв оисонисгеотвг рптегз, ргппег-с))гпегз, апъ) ехсезз г)ХТРз !гогп ргерага6опз ог агпр66ес) Тз!ъ!А.

багз!, геыь!иа! г1!ъ!Трз !п гЬе соп6пшп8 ргезепсе ог" гез!с)иа! гЬегтозгаЫе РХА ро1угпегазе сап сотргот!зе гпапу ог йе тегЬос)з с)еяцпес! Го Гаг!ог ГЬе епг!з ог йе агпр!г6ес1 Р!ъА гп ргерагаъюп гог с!оп)п8 1Р1еазе зее РгоъосоЬ 4, 5, апс) 6). 8есопй гЬе очегаЪипс)апсе ог йе о68опис!еогЫе ргипегз изес) го Вепегаге йе агпр1гбес1 Р!ъ)А гпау 1оъчег гЬе е6)с)епсу ог" зиЬзес)иепг РСКз гп ъчЬгсЬ гЬе атр66ес) Тг!ъ!А !з изес) аз а гегпр1аге. ТЫгд, рптегяПтегз гпау сопгпЬиге ЫПЬ сопсепггагюпз ог" гезгпсгюп ягез гЬас гпау зиссеяйПу согпреге чбй йе гегт!и! ог" атр66ес! РХА гог с1еача8е.

Вечега1 тегЬог)з аге ачаПаЫе Го с1еапзе агпр66ес) Р!ъ!А ог" ипъчапъес) сопъат!папъз, шс!иг!!п8: ° гЬе ггайгюпа1 ехггасг!оп ъч!гЬ РЬепоЬсЫого)огт (з!оъч, теззу, апс) согпрага6че1у !пейк!епг, Ъиг Воос) гог япш1гапеоы ргосезяп8 ог' тапу затр!ез) ° сЬготаго8гарЬу оп апюпк я1ка Пе! геяпз (зисЬ С)!Аргер ог ©а8еп РСК Рип6са6оп )с)гз), 81аззтП)с (610101 Сепес1еап И), ог сЬаоъгор!с я1!са-Ъазес) геяпз (Рготе8а'з 'ъ'ъ!гагй РСК Ргерз). ТЬе ягепцгЬз апс1 1ипКа6опз ог" йезе сЬгогпагоПгарЫс тегЬог!з аге йзсиззес) ш ъ)егаП гп СЬаргег 1, Ргогосо! 9.