Крутецкая, Лебедев, Курилова - Механизмы внутриклеточной сигнализации - 2003, страница 2

Эффекэорные системы, связанные с б-белками, включаю~ в себя аденнлазциклазу, цГМФ-специфнчнуэо фосфоднэстеразу фоторецепторов, фосфолипазу б, фосфолппазу Аз и несколько типов ионных каналов. Полагают, что возможна двойная регуляция функций эффектора со стороны С-белков: более быстрая прямая регуляция С-белком и более медленное непрямое влияние через вторичные посредники, образующиеся с участиелэ б-белков ( э'ашп( е! а1., 1988; Вгони, В)глЬацшег, !988; )чеег, 1995) 5.1.

Сз руктура С-белков С-белки являются гетеротримерами, состоящими из гь, (3- и субъедиииц (Нйг)еЬгапг(1 ег а(.. 1984), которые при акгвации диосоциируют на комплекс п-ГТФ и Ру-линер. Именно а-субъединицы, имеющие мол. массу 39000 — 50000 Да, связывают и гидролизуют ПФ, определяют специфичность связывания С-белка с рецептором и эффектором и являются уникальными для каждого С-белка (Вес)гаеп ез а!., 1987).

Методами молекулярного клонирования к настоягцему времени выявлено !6 генов, кодирующих различные а-субъединицы С-белков позвоночных (1уепйаг, В(щЬапщег, !990; )чеег, 1995). Выделяют четыре основных класса ц-субъедиииц С-белков: а, (четыре вида а„ащ„а,я), а; (ал, а,-, и,зы о„, а»ь цяь а „„, а» а„), а (о, аи, ам, ам, ам) и а~э(ась иц) (Неег, 1995; Напсос)г, ! 997; Зргапй, 1997). Все а-субъсдиницы содержат аминокислотные последовательности, высокогомологичные последовательностям в бактериальном факторе элонгации, ко~орые участвунл в связывании и гидролизе ГТФ. К числу таких участков относится последовательность из 18 аминокислот, неизменная во всех клоннрованных и-субъединицах позвоночных и служащая для их идентификации.

Этаг фрагмент ограничен с двух сторон лизином или аргинином. На основании данных реитгеноструктурного анализа бактериального фактора элонгации и амфипатического анализа первичной структуры а„, и» а„а,„и а, была установлена вторичная структура «усредненной» а-субъединицы, в которой выявлены участки связывания гуаниновых нуклеотидов, возможного взаимодействия с рецептором (С-конец) и ~37-ялмарами (1Ч-конец), а также места АДФ- рибозилирования при действии холерного токсина (ХТ) и коклюшного токсина ( КТ) (Маз1егз ег а!., 1986; В!гпЬапгпег ег «1., ! 990а). а-субъединица состоит из двух доменощ 1) ГТФ-азного домена, содержащего участки связывания гуаниновых иуклеотидов, рецепторов, эффекторов, ру-димера и 2) спирального домена, участвующего, повидимому, во взаимодействии с эффектором (Ь)еег, 1995; Бргапй, 1997) (рис.

4). Методами очистки и молекулярного клонирования идентифицировано 5 изоформ (3-субъединицы смол. массами 35000-36000 Да (Сао ег а!., 1987; Ыеег, ! 995; Бргвпй, ! 997) и 1О изоформ 7-субьединицы с мол, массой 6000-10000 Да [Нйг)еЬгапг)1 е! а1, 1984, ! 985; г'агвппащ( ег а!., 1985г Вргвой, 1997). В пати»ной форме (3- и у-субъелнницы существуют или как часть голо-С-белков в связи друг с другом и с асубъелиницей, или в виде смеси свободных Ру-димеров (Мацега ег а1., 1986).

Рнс. 4. Структура а-субъединнцьг Сгбелка. Показан комплекс а-субъединицы с негилролизуемым аналогом СрФ (тгруб (П7руб). Рис. 5. Струк гура ))-субъеднницы Сгбелка. На )Ч-конце полипептндной цепи расположена амфипатнческая а- спираль, за которой следуют 7 повторяюгцикся единиц из 43 аминокислот (так называемые %)3 повторы).

Этот С-концевой домен из ЗОО аминокислот носит название)3-пропеллера(внд спереди). )3-субъединица содержит два типа структур; на М-конце расположена амфипатическая а-спираль, за которой следуют 7 повторяюьзихся единиц из 43 аминокислот (так называемые %(3 повторы). Этот С-концевой домен из 300 аминокислот носит название ))-пропеллера. Семь %() повторов образуют лопасти пропеллера ()Чеег. ) 995; Бргапб, ) 997) (рис.

5). 7-субъеднница состоит из двух спиральнык сегментов, соединенных петлей. М-концевая спираль 7-субъедпннцы взаимодействует с М- терминальной спиралью 0-субъедиг1нцы. Вторая спираль т-субъсдиницы ы расположена около 5-го и б-го %(3 повтора (около 5-ой и б-ой лопасти пропеллера) (3-субъединицы, а Г-терминальная петля у-субъединицы локализована в гидрофобном кармане на поверхности (Ьсубъединицы (Неег, 1995; Яргапй, 1997). а-субъелиница может взаимодействовать как с так и с 7-субъединицей. Так, 30 аминокислот ца Н-конце псубъедииицы взаимодействуют с 1-ой лопастью пропеллера (иервым и вторым %(3 повтором) О-субъединицы (Ь!еег, !995; Вргапй, ! 9971 3.2.

Регуляция активности С-белков Регуляторный цикл б-белка начинается в тот момент, когда связанный с лигандом рецептор катализирует два процесса: 1) освобождение связанного с П-белком (ДФ; 2) связывание ГТФ с последующей активацией б-белка (Вгозч!ъ В!гпЬацглег, 1988; Ыеег, С!арйаю, 1988; Неег, 1995) (рис. 6). Процесс акгивации включает в себя также два этапа: 1) конформационное изменение б-белка. которое превращает связывание ГТФ из легкообратимого в прочное, практически необратимое; 2) лиссоциацию субъелиниц С~-белка, что приводит к образованию специфического активированного комплекса и-ГТФ и 07- димеров. Именно активированные а-субъединицы (а-ГТФ) регулируют функции эффекторов (В!гпЬащпег е! а1., 1990а, 1990Ь). Деактивация комплексов а-ГТФ происходит при гидролизе ГТФ до ГДФ, что является неотьемлемым свойством всех а-субьеднииц (Н!1г(еЬгапбг е) а1., 1985). Гидролиз ГТФ превращает активированные и- ГТФ комплексы (с низким сродством к (3у-димерам) в неактивные а-ГДФ комплексы (с высоким сродством к (37-димерам).

Это приводит к ассоциации а-ГДФ с 07-димером с образованием гетерстримера С-белка. Таким образом, 6-белки представляют собой систему с регуляцией по принципу отрицательной обратной связи (оис. б), При последующей активации рецепторов и связывании ГТФ а-субъединицей цикл повторяется снова (81егпьте!з, Рапй, 1990; )чеег, 1995; 8ргап8, 1997). Важным свойством С-белков, позволяющим эффективно изучать их участие в тех или иных внутриклеточных процессах, является возможность их необратимой активации (или инактивации), минуя стадию стимуляции рецептора агонистом.

Необратимую активацию ббслков вызывают негидролизуемые анапе~и Г'ТФ: ГТФуь (гуанозин-5сО- (3-тиофосфат)) и ГЬ(Ф-Р(НН)Р (5'-гуанилилимидодифосфат) (Сйщап, 1987). К необратимой иналтивации Гэ-белков приводит их связывание с негидролизуемым аналогом ГДФ - ГДФ(18 (гуанозин -5'-О-(2- тиодифосфат) (ВипЬащпег е! а1., 1990а, 199ОЬ). Чрезвычайно полезным для изучения роли С-белков а активации клеток оказалось применение таких природных бактериальнах ялов, как ХТ н КТ, гз которые АДФ-рнбозилируют б-белки (В!гпбаоюег е! а!., 1989, 199ба). ХТ приводит к постоянной активации аденилатциклазы, действуя на а,- субъединицу и подавляя ее 1'ТФазную активность. КТ. наоборот, ин~ ибирует активность агсубъединицы. ;1 Ьиаивьаь Ч Рис. 6. Регуляторный цикл гетеротримерного С-белка.

Активироваиный лигандом рецептор 11) катализирует освобождение связанного с а-субъединицей б-белка 1ДФ (б0Р) и связывание ГТФ !ОТР), что приводит к активации б-белка !2). С-белок диссоциирует на а-ГТФ и ру-линер !3), которые активируют или ингибируют различные белки-мишени в клетке (4). Деактивация комплекса а-ГТФ происходит при гидролизе ГТФ до ГДФ 15). Гидролиз ГГФ преврашает активированные а-ГТФ комплексы в неактивные а-ГДФ комы~виске а-ГДФ связывается с ))у-димером с образованием неактивного гетеротримерного б-белка (6).

а, р, у - субъединицы б-белка. Удобным инструментом для изучения б-белков является комплекс А!Р, . Показано, что он необратимо активирует б-белки типов б,, С, и б, (Сосьсгой, 1987; бйюап, 1937). Считаеюя, что А!Рз имеет структуру, сходную с фосфатной группой, и может взаимодействовать с ГДФ„ связанным с а-субъединицей б-белков. Таким образом, А)ря активирует ы и-субъединицу О-белка, связываясь с ГДФ и имитируя присоединение третьего фосфата (В18ау е! а1., 1987). Установлено также, что О-белки являются субстратом для модификации такими зндогенными энзимами, как протеинкиназа С (Руле е! а!., 1989).

Кроме того, О-белки подвержены прямой рецептор- независимой активации кагионными амфифильными нейропептидами (субстанция Р) и пептидами из яда насекомых (Мосай е! а1., 1990). ЗЗ. Связь С-белков с мембраной В первичной структуре всех субъединиц О-белков отсутствуют гидрофобные, пронизывающие мембрану домены, и до недавнего времени оставались неясными молекулярные механизмы связи О-белков с мембраной. В то же время было понятно, что связь О-белков с мембраной является необходимой для обеспечения соответствующей ориентации компонентов цепи передачи сигнала.

В последние годы было установлено, что для ассоциации О-бедков с мембраной важно ацилирование О-белков жирнокислотными радикалами, что, как известно, сильно увеличцваег гидрофобносгь белков. Выявлены два типа липидных модификаций субьединиц 6-белков - миристонлирование и изопренилирование белковой цепи (Яр(ейе1 ет а!., 1991). Большинство а-субъединиц ведут себя как интегральные мембранные белки: они не вьгделяются из мембраны при действии буферов с разной ионной силой (Впзз е! а1., 1987), но освобождаются при воздействии детергентов или высоких рН (Ацгйй(ег ег а!., 1990). Парадоксально, но очищенные а-субъединицы ведут себя как гидрофильные белки, так как не могут связываться с искусственными фосфолипидными пузырьками в отсутствие Бу-комплекса (Б!еглме(з, ! 986). Это послужило основой для предположения о том, что (37-комплекс может служить якорем для а-субъединицы в мембране.

Если зто так, то можно было бы ожидать, что алтивация О-белка и диссоциация асубъединицы от ()у-комплекса будут приводить к освобождению асубъединицы из мембраны. Однако бьшо показано, что активация мембранно-связанныл О-белков даже при действии негидролизуемого аналога ГТФ (ГТФуя) приводит к очень медленному освобождениго асубъединиц или освобождения не налюдается совсем (М)рййап е! а1., 1988) Очевидно, что п-субъединицы могут связываться с мембраной независимо от Ву-комплекса.

Воздействие трипсина на обработанные ГТФуз мембраны вызывает освобождение растворимых а-субьелиниц, у которых отсутствует Х-концевой фрагмент (!-2 кДа), что свидетельствует о том, что с~-субъединицы связаны с мемб!заной своим !ч-концевым участком (Е(бе е! а!., !987). 4. Структурно-функциональная организации сигнальных систем в клетках 4.!. Аденилатцнклазный путь передачи информации Во всех клетках животных н растений имекпся два основных п)ти передачи сигнала, различающихся по вторичным посредникам аленилатциклазный и фосфоинозитидный. Эти пути передачи сигнала имеют много общего. В обоих случаях информацию от первого звена рецептора получают и передают через мембрану в цитоплазму зак называемые С»белки, активируюшиеся при связывании гуанозинтрифосфата (ТТФ).