Крутецкая, Лебедев, Курилова - Механизмы внутриклеточной сигнализации - 2003, страница 7

Этот фрагмент взаимодействует с фосфолипидамн Са -зависимым образом и участвует в транслокацни ПКС к мембране при увеличении !Са ],. Изоформы протеинкиназы С иПКС и аПКС. не имеющие фрагмента С2, не зависят от внутриклеточной концентрации Са (Рбя)ииш)га„!992, 1995). Классические кПКС активируются Са . 0АСь кислым фосфолипидом ФС. цис-ненасыщенными жирными кислотами. 0АС активирует изоформы кПКС таким образом, что повышается их сродство к микромолярным концентрациям Са . Совместное лействие 0АС и цисненасышенных жирных кислот еше больше повышает сродство изоформ кПКС к Са и вызывает полную активацию фермента при обычной концентрации Са в цигозоле. Изоформы нПКС активирукпся 0АС и ФГ а изоформы аПКГ - ФГ и цис-ненасыщенными л нрными кислотами ! Н)в!»(ж»ка, 1992, 1995).

В нормальных условиях ПКС находится в основном в цито але в неактивной форме. При стимуляции происходит транслокация фермента к плазматической мембране. элементам цитоскелеэа. ядру. В мембране образуется комплекс ПКС-0АС-Са '-ФС. ПКГ взаимгдействует электростатически с отрицательно заряженными фосфолипидами мембран.

В связывании с липидами участвуют также два богатых цнс»вином пальцеобразных участка фрагмента С!, фрагмент С2 и псевдосубсзратная последовательность фермента ()Ч)з)»|зп(га, 1992, 1995). ПКС связывается со специфическими заякорнвающими белками, расположенными в различных участках клетки: аннексинамн, белками цитоскелета, ядерными белками. В последнее время клонированы виутриклеточные белки с мол. массой 30-36 кДа, являющиеся рецепторами для активираванной ПКС Эти белки пыли названы ВАСКв !гесергогз рог асг!кже»5 С-!г)паве) (Мое)»(у-Вовеп е! а1., !991; Коп ег а1., 1994; МосЫеу-ровен, 1995). КАСКз специфически связывают ПКС только в присугствии ее активаторов (0АСч ФС„Са ) и способствуют ее транслокации к мембране.

Так, из мозга крйсклонирован белок ВАСК! (мол, масса 36 кДа), являющийся гомологом ()-субьединицы 0-белков (йоп ег а1., 1994). Связывание с КАСКз обеспечивает, по-видимому, определенную локализацию специфических изоформ ПКС в клетке и их компартменгализацию с субстратами. Для выявления участия ПКС в различных клеточных процессах используют активатор протеинкиназы С форболовый эфир РМА (4- форбол-12-миристат-13-ацетат) (рнс. 13).

РМА и ряд других форболовых эфиров лс"ко проникают в клетку и, имея структурное сходство с 0АП, взаимодействуют с его участком связывания на молекуле ПКС (Н(з)»)ж»)га, »»». »»ви». в ч Мзщ„„,я ~ прямые активаторы ПКС. з ингвбиторов ПКС: стауроспорин. дибукаин, тетракаин, хлорпромазин, спермин, сфингозин. Специфическими ингибнторами ПКС являются кальфостнн С (Кобауавйй е! а1., 1989), хелеритрин и соединение Н-7 ( ! -(5-нзохннолин сульфонил)-2-метил-. пипервзин) (НЫа)га ег а(., 1984; Кажапю!о, Н)г)а(га, ! 984; НнЫга, КоЬаувзЫ, 1992) (рис. 13).

о.-изоформа кПКС стимулируется нормальными спиртами. Показано, что спирты изменяют структуру липидной фазы мембраны и увеличивают связывание ПКС с мембраной (В)»еп е! а1., ! 999). Для того, чтобы ответ клеток на стимул был регулнруемьнк необходимо существование систем, прекращающих дейсзвие вторичных лосреэг»иков. Влияние 1Р» прекращается с помощью фосфатаз. лефосфорнли)пчощих это соединение. Дейв»вне 0АП может ограничиваться с помощью двух механизмов. Благодаря действию диацилглицеринкиназы он может быть фосфорилирован до фосфатилной кислоты, либо гпдролизоваи с помщцью диацилглицеринлипазы.

Оказалось, что продукты этих путей деградации 1)АО имеют свою важную роль в процессах регуляции функциональной активности клетки (ВеггЫ3е, !гч!пе, 1939; Вегпг(бе. 1993). Во-первых, фосфатидная кислота может участвовать в регуляции входа ионов Саз в клетки. Во-вторых, во втором положении остатка глицерина фосфоинознтидов обычно находится арахидоновая кислота, которая и освобождается нз ОАО (диацилглицеринлипаза) или из фосфатидной кислоты (фосфолипаза А ).

В настоящее время показано, что освобожление арахидоновой кислоты часто сопровождает процессы активации клеток, связанные с увеличением (Са )ь и что арахидоновая кислота и многочисленные ее пролукты являются еще одной сигнальной системой в клетках.

4З. Арахидоновая кислота и ее продукты: участие в процессах внутриклеточной сигнализации В последние голы получены ланные, позволяющие рассматривать арахидоновую кислоту (АК) и ее продукты в качестве еще одной системы вторичных посредников (Вечап, %оЫ, ! 987). Во многих случаях показано, что АК и ее производные могуг взаимодействовать с другими системами передачи информации в клетке, людулируя их сигналы (Ахе1гог) ег а1., 1988; Ахе1гог), 1990). Обнаружено, что АК или ее продукты могут влиять на активность ФЛС (М!ге-3)ц!я е! а)., 1989; Мпгрпу, %е!)с, 1939), АЦ (Вйопн' ег а)., 1980), гуаннлнгциклазы (Оегхег ег а1., 1986; %аЫгпац Мцгад,!987), ПКС (Мсрпай ег а1., 1984; бпеагпзап ег а1., 1989) и приводить к освобождению Са из виугриклеточных депо (%о)Г ег а!., 1986; Спогч, )опг)в( 1990).

Показано, что в передаче сигнала от рецептора к фосфолипвзе А — основному ферменту, ответственному за образование свободной АК, - участвуют О-белки (Ахе1гог) ег а1., 1988; Ахе1гоб, 1990; Вцгсй, 1990; см. обз. Крутецкая, Лебедев„ ! 992б). Показано, что АК и ее ме~вболитьх выделяясь из клегок„но~уз выступать в качестве местных гормонов и мвлиаторов, акз ивируя рецепторы той же клетки или окружающих клеток, играя при этом важную роль в регуляции различных физиологических процессов, каких как иммунный ответ, секреция и др.

(1гт!пе, 1982; Иеед!етап е1 а1., 1986; Вцгйоупе ег а1., 1937; Ахе!год е! а)., 1988; )4охазва ег а1., 1991; Ызсоч!гоп, Санг!ау, 1994). Солержание АК и ее мегаболитов в органигме увеличивается при многих патологических состояниях: при воспалительных процессах (Оагнез ег а1., !984), атеросклерозе (Нацаг. Рощегынг. 1992), ишемической болезни серлца (Ниапй ег а1., 1992). Механизмы образования свободной АК а клетках, пути метаболизма АК и производства очень широкого спектра биологически активных соединений (эйкозаноидов) подробно рассмотрены нами ранее (см.

обз. Кручецкая, Лебедев, 1993). 4.3.1. Механизмы образования свободной арахидоновой кислоты в клетках Арахидоновая (эйкозатетраеновая) кислота представляет собой полиненасыщенную жирную кислоту (20:4) и является основным компонентом фосфолипидов клеточных мембран. В клетках млекопитающих АК находится в глицерофосфолипидах предпочтительно в положении яп-2 (1гчпе, !982). В эндотелиальных клетках АК входит главным образом в состав фосфатилилхолнна, фосфатидилэтаноламина и фосфатидилинозитола (уг)эаг(еу ег а!., 1990). В тромбоцитах АК содержится в фосфатидилхолнне. фосфатидилэганоламине, фосфатидилсерине и фосфатидилинозитоле ()4огатча е! а!., 1991). В макрофагах АК составляет 2588 жирных кислот мембран (Ясогг ес а(.„ 1980).

ЛК освобождается иэ клеточных мембран в ответ на рецепторзависнмую и рецепториезависимую стимуляцию различных клеток (Хеег)!ешап е! а)., 198б; Ахейод е! а!., 1988; Ахе1гог(, 1990). Различают несколько механизмов освобождения АК из фосфолипидов мембран (!гчше, 1982„Ахе!гсн1 ег а)., 1988; Ахе1гог), 1990; Капа, Но!цп, 1990). 1. Наиболее прямой механизм вш1ючаег в себя непосредственное освобождение ЛК из мембранных фосфолипидов под действием фосфолипазы А.

Фосфолипазы Аз катализируют гидролиз сложноэфирной связи между АК и глицерофосфолипидом в положении зп-2. Эти фосфолипиды включают в себя фосфагидилхолин, фосфатилилэтаноламигц фосфатидилсерин, фосфатцдилггнозитиды, фосфагидную кислоту и плазмалогены. В результате гидролиза образуются свободная АК и лизофосфолипиды. 2. Менее прямой механизм состоит в освобождении ЛК из диацилглицерола (1-ацил-2- арахидоноил глицерола) при действии диацилглицероллипазы.

Диацилглицерол образуется при возлействии фосфолипазы С на некоторые фосфолипиды, такие как фосфвтидилхолин и фосфатидилинозитол. Ингибитором диацилглицероллипазы является агент КНС 80 267 (Чгс(зз, 1лзе1, 1991). 3. Кролге того, диацилглицерол может активировагь протеинкиназу С, которая в свою очередь стимулирует фосфолипазу Аз, катализируюшую освобождение АК из фосфолипидов (%11аг!еу ег а!., 1990). 4. Возможно также образование АК в результате активации мембранных рецепторов (например„рецепторов эпидермального фал-гора роста), приводящей к стимуляции связанной с ними тирозинкиназы, которая в свою очередь непосредственно активирует фосфолипазу А, (Рерре!елбоясй е! а(., 1992).

Фосфолипаза Аз катализирует освобождение АК из фосфолипидов мембран. Образование свободной АК в результате действия фосфолипазы Аз ингибируется производными гндроксибензилидинмалононитрила, известными как тирфостины и являющимися специфическими блокаторами тнрозинкнназы рецептора эпидермального фактора роста (Но!озт!гв, Вша, 1992). 5. Диацилглицерол может фосфорилнроваться диацилглицеролкиназой с образованием фосфатидной кислоты. АК освобождается нз фосфатидной игслоты при лействии фосфолипазы А,. Ингибитором 1,2-диацилглицеролкиназы служит саелиненне К59022. В различных клетках реализуется один или несколько механгпмов образования свободной АК. Полагают, например, что в фагоцнтах (макрофагах) АК освобождается из мембран в основном в результате действия фосфолипазы А, (Нвппйоп, Аг)жпв, 1987; 1.евйе е! а)., 1983; %11)сапдег, бппгйег, 1989; Ва1з!лг)е ег а1., 1990„1992).

В эндотелиальных клетках в освобождении АК учасгвуюц по-видимому, и фосфолипаза Аз, и фосфолипаза С (Ф'11а!(еу е! а)., 1990). Для эндотелиальных клеток показано также участие протеннкнназы С в регуляции продукции АК. Г1ротеинкнназа С активирует фосфолипазу Аг, катализирующую выделение АК (Саг!ег ег а(., 1939; эт'Ьаг)еу е! а1., 1989). В тромбоцитах человека только 12-!558 АК высвобожлается с участием фосфоинозитид-специфичной фосфолипазы С и диацилглицероллипвзы (механизм 2). Основная же часть свободной АК образуется при прямом действии фосфолипазы Аз (Хохазча е! а1., ! 991).