Крутецкая, Лебедев, Курилова - Механизмы внутриклеточной сигнализации - 2003, страница 3

0-белки активируют 'фвндйтвяьный" фермент на внутренней стороне мембраны, который способствует превращению молекул вещества-предшественника в молекулы вторичного посредника. Коночные стадии разных способов передачи сигналов сходны: вторичные мессенджеры вызывают изменение структуры клеточных белков.

Концепция сигнализации с участием вторичных мессенюкеров появилась с открытием Свзерлендом роли циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) в процессе гликогенолиза (Бо!пег!апб, йлИ, 1958; Бп!пег!вид, !972). В дальнейшем была показана важная роль цАМФ в регуляции различных клеточных процессов, звких как пролиферация, секреция, сокращение, мембранный транспорт, нейропередача, малигнизация клеток и т.д. Было обнаружено, что влияние на внутриклеточный уровень цАМФ характерно для целого ряда гормонов и медиаторов.

В аденилаж!иклазном пути передачи информации внешний сигнал после взаимодействия со стимулирующим рецептором через 6-белок типа С„активирует "усилительный*' фермент аденнлагциклазу (АЦ) (рис. 7). АЦ катализирует превращение аденозинтрифосфата (АТФ) в цАМФ (рис. 8).

Субстратом для АЦ является М» *АТФ или Мп 'АТФ (1лп е! а1., ! 997). Свободная АТФ дддддтся ингибиторы вктидиоатц АЦ. Другие агонисты, связываясь с ингибирукипими рецепторами, активируют С;-белки, которые ингибируют АБ!. В последнее время появились данные о том, что аденилатцнклазная система может активирпваться не только при стимуляции рецепторов, связанных с С»белками, но и при активации рецепторов, имеющих собственную тирозинкииазную алтивность (рецепторы инсулина и зппдермального фактора роста) (Плеснева и др., !996).

Так , в цитоплазматическом домене ()-субъединицы инсулинового рецептора выявлены два участка связывания с Сч и С, белками (Шпаков, 1996). ч Рис. 7. Схема адеиилатциклазиого пути передачи сигналан Активация рецептора лигандом приводит к активации гетеротрнмерного С-белка, который диесоциирует на а-ГТФ и ))у-динар. а-ГТФ активирует аденилатциклазу, катализирузошую образование ц АМФ из АТФ 1по Напсос)г, 1997). АТУ о о Р о сн2 о янин о и', ! н н -о-е-о н ! о но он .о-я-о н ! о — н н ..о ! о н н н н но он ягягяя Рис. б.

Образование и гидролиз и АМФ. Сус!гс АМР - ц АМФ. Фосфолнзстераза катализирует гидролиз ц АМФ до бцАМФ (по Напсос)с, 1997). ы оц! гЧ'Ъ~Х !и Кат. домены г--. Рис. 9. Топология в мембране вдеиилатциклазы. Показаны 12 трансмембранных о-спиральных сегментов и 2 цитоплазматнческих каталитических домена.

Конечные стадии передачи сигнала с помощью цАМФ осуществляются с участием цАМФ-завнсимых протеинкиназ (протеинкинаг А), которые фосфорилируют определенные белки-мишени по остаткам серина или треонина. Уменьшение концентра!ии цАМФ происходит с помощью фосфодиэстеразы, каталнзирующей расщепление цАМФ с образованием АМФ. В экспериментальных работах в качестве ингибиторов фасфодиэстеразы обычно используют теофнллин, 3-изобутил-1- и к у"~~ ку фермента (Авдонин, Ткачук, 1994; Ре!егзеп, Веггк)бе, 1995).

4.1.1. Структура и регуляция яденилатциклазы АЦ, ключевой фермент аденилатцнклазного пути передачи сигнала, обнаружен во всех типах клеток. В настоящее время клонировано 8 изоформ (типы 1-ЧВ!) АЦ из разных тканей (Кгор!пзЫ е! а!., 1989; Соорег е! а)., 1995). Показано, что АЦ является интегральным мембранным белком (1080-1248 аминокислот, мол. масса 120 кДа), полипептидиая цепь которого имеет ! 2 гидрофобных трансмембранных сегментов, образованных 20-22 аминокислотами каждый. Трансмембранные сегменты обьединены в два кластера по 6 в каждом, а между кластерами со стороны цитоплазмы расположены два длинных фрагмента полнпептндной цепи с мол.

массой 43 кДа !рис. 9). Во внеклеточную область экспонированы сравнительно небольшие фрапчены белка, имеющие участки )4-глнкозилирования. По своей струкзу!зе АЦ удивительно напоминает С1-канал регулятора трансмембранной проводимости при цнстофиброзе (СГТК) и гликопратеин Р - белок. обеспечивающий резисзентность ьо мгюгим лекарствар. как >в предполагают. за счет своей способности выводить их из клетки (Ооцезп>ап, Раман, !988; к!огс)ап е! а).. 19891. Трансмембранные сегменты не отличаются высолнм консерватизмом у разных изоформ АЦ, а также не имеют гомологин с высоьоконсераативными трансмембраннымн сегментами ионных каню>ов (Сацега1!. 1995). Два цитоплазгиатических фрагмента АЦ включает два АТФ-связывающих домена, которые гомологнчны друг другу (Кп>р)пз)о! е! а1., 1989).

Участок связывания Са Укальмодулина с АЦ ! типа также расположен в первом цитоплазматическом фрагменте. Специфическое акгивирующее действие на АЦ оказывает форсколин, получаемый из травянистого растения Со1ецз >огз)соей В связи с этим, он широко используется в экспериме>пвх как инструмент для выяснения роли аденилатциклазной системы в реализации той или иной биологической функции. Форсколин связывается, по-видимому, с тем же участком фермента, с которым связывается АТФ (1 ш е! а1., 1997). Показано, что три кольца в структуре форсколина и вденозина имеют сходные комбинации групп, образующих гидрофобные и водородные связи. Считается обшеприняз.ым, что активация АЦ происходит в результате ее прямого взаимодействия с а,-субьеднницей О,-белка ())огй>цр е! а1., 1983(>).

Ингибирование АЦ осушесгвляется при прямом взаимодействии АЦ с а,-субьединицей О,-белка (Кмж)а ег а1., 1984; Казада ег а!., 198б) илн при взаимодействии с ру-камерами различных О-белков ()чогй>цр е! а1., 1983а; )Чеег е! а!., 1987). Установлено, что для связывания с ))у-химерами О-белков важен фрагмен~ из 5 аминокислот (61п-Х-Х-О)цАгб) А1 1 типа П (СЬеп е1 а1., 1995). В гюследнее время показана сложная множественная регуляция всех клонированных изоформ АЦ. Обнаружено, что один подтип АЦ активируется а,-субьединицами О,-белков и не зависит от )3у-димеров. Другой подтип АЦ активируется о,псубьединицами и синергично акгивируется далее )37-субьединицами. Для третьего подтнпа АЦ характерны активация о,-субьединицами и иигнбирование при действии (37-димеров (Тап8, О!1шап, 1991].

Установлено„что все восемь клонированных изоформ АЦ регулируются одной из ветвей фосфоинознтидного пути. Аденилатциклазы 1, 1В и Ч11! типа, экспрессированные в клетках гиппокампа и мозжечка„стимулируются ц,-субьединицами О;белков н внутриклеточнымн ионами Са' и ингибируклся Ру-субьединицамн О- белков. Протеинкиназа С не оказывает стимулирующего действия на >>и изоформы АЦ. Аденилатциклазы !1, 1У и УВ типов, идентифицированные в определенных отделах мозжечка.

стимулируются п,-субьединицами, протеинкиназой С н Ру-димерамн. В хвостатом ядре мозга н миоцнтах гя сердца идентифицированы аденнлатцнклазы Ч и У1 типов. которые алтивируются а,-субьединицами и ингнбпруются при увеличении [Са Протеинкиназа С н ()у-димеры не сказыва>о> влияния на эгн изоформы А Ц (Сгюрег е! а1., 1995) . Установлено. гю стимуляция АЦ 1, РВ и УВ! типов Са опосрелована кальмодулииом, который может быть удален и добавлен вновь для восстановления чувствительности к Са> (Соорег е! а)., 1995). Функциональные и ульз раструктурные исследования показали„что АЦ локализована рядом с каналами входа Са в клетки.

Так, в клетках гиппокамйамлекопнзвюших "АЦ располсякена рядом с )чМОА- рецепторами. Ионы Са ', входящие в клетку по каналам НМОА- рецепторов, вктивирукп Са '/ кальмодулин-стимулируемые АЦ! илн У!И типов, что приводит к увеличению концентрации цАМФ. цАМФ лиффундирует на очень маяые рассгояния и активирует протеинкиназу А, которая заякоренв в определенных участках клетки с помощью специфических заякориваюших белков АКАРз (сАМР-4ерепг(еп! ргоге!п (г(паве апс!>от(пя рго!е!пз) (Соорег е! а!., !995).

В возбудимых клетках (миоцитах сердца) Са>, входящий по / потенциал-зависимым Са> -каналам В типа, ингибируег АЦ Ч и Ч! типов (Соорег е! а1., 1995). Для невозбудимых клеток показано. что АЦ колокализована с каналами депо-зависимого входа Са '. Обнаружено, что только Са, вхолящий в клетку по депо-зависимым Са -каналам, а ис Са ', освобожденный нз внутриклеточных депо, регулирует активность АЦ.

Так, в клетках глиомы линии Сб-2В Са"-ингибируемая АЦ типа У1 функционально и пространственно колокализована с депо-зависимыми каналами входа Са (Сп(опо е! а1., 1995; Еаяа» е! а1., 1998). Показано, что золько депо-зависимый вход Са', вызванный тремя независимыми методами (приложение тапсигаргина, иономицина или УТФ), а не мобилизация Са ' из депо, ингибирует синтез цАМФ в зтих клетках.

Тесная пространственная взаимосвязь между АЦ и каналами депо- зависимого входа Са подтверждается также тем, что разрушение цитоскелета не влияет на регуляцию АЦ внутриклеточным Са (Раааа е! а!., ! 99в). Тесная взаимосвязь с каналами депо-зависимого входа Са показана также для Са '-стимулируемых изоформ АЦ. Обнаружено. что Са -стимулируемые АЦ ! и У!В типов, экспрессированные в клетках линии НЕК 293, регулирую~ся исключительно лепо-зависимым входом Са . а не Са, освобожденным из депо ! Райан с! а(.. ! 996).