Крутецкая, Лебедев, Курилова - Механизмы внутриклеточной сигнализации - 2003, страница 6

Каталнтическая активность всех изоформ ФЛС зависит от Са" (Сгоо!ге, Веппег, 1989). Центр связывания Са находится, по-вндимому, нв самой молекуле ФЛС. Показано, что ФЛС-Ь и ФЛС-у имеют последовательности, сходные с так называемой ВР-рукой - доменом, обеспечивающим высокоаффинное связывание Са в квльмодулине и некоторых других Са '-связывающих белках (Вшгосб, Сох, 1990). ФЛС очень специфична в отношении фосфоинозитидов и практически не гидролизуег другие типы фосфолипидов.

Предпочтительными субстратами являются Р1рз и фосфатидилинознтол-4-фосфат (Р1Р). В с~рукгуре всех нзоформ ФЛС отсутствуют гидрофобные фрагменты, которые могли бы обеспечивать их взаимодействие с мембраной (Сгоо(ге, Веппе11, 1989; й!зее е! а1., 1989). Тем не менее, с помощью специфических антител можно идентифицировать связанные с мембранами у-изоформы (КЬее ег а)., 1989). Ло сих пор остаются неясными механизмы связи ФЛС с мембраной. Возможны как специфическая ассоциация с какими-либо белковыл)и (б-белки, рецепторы агонистов) и!нли лнпидными компонентами мембран, так и постгрансляционные модификации типа ацилирования жирными кислотами (Мо!ть ег а1., 1990). 4.2.2.

Фоефатпднл ииозитол-4,5-днфосфат (Р1Р,) Активация ФЛС приводит не только к образованию двух вторичных мессенджеров ПАС и 1Р,. но и к уменьшению концентрации Р1Р.. являющегося минорным компонентом мембранных липидов. При стимуляции клеток может гидролизоваться до 5058 от общего количества Р1Рз в клетке. Известно также, что весь клеточный пул Р1Р не доступен для ФЛС.

Следовательно, в области активнрованной ФЛС концентрация Р1Р может упасть практически до нуля и оставаться на этом уровне до нового синтеза. В последнее время стало очевидным„по Р(рз является важным компонентом нескольких путей внугриклегочной сигнализации, и флуктуации концентрации Р!Рз могут играть мессенлжерную роль в клетке (1.ее, ййее„1995). Так, показано, что Р!Рэ служит кофактором для фосфолипазы О, вызывающей гндролиз фосфатндилхолина до фосфатидной кислоты и холина.

Кроме топ>, Р1Рэ служит участком связывания в мембране для белков, содержащих РН-домены (Наг1ап е! а!., 1994). РН-домен обнаружен во многих сигнальных белках, таких как плекстрин, во всех изоформах ФЛС, в кнназе ))-адренергических рецепторов. Р1Рэ участвует в локализации этих белков на поверхности мембраны. Таким образом, уменьшение концентрации Р1Р при активации ФЛС может приводить к освобождению многих сигнальных белков с поверхности мембраны ((.ее, ййее, ! 995). Обнаружено также, что Р! Рз регулирует сборку/разборку актиновых филаментов в клетке (Адегегп, 1992; 1 ппа, Нйй 1992; )апшеу, 1994; Магйп, 1998).

Показано, что Р(Рз может взаимодействовать с целым рядом актинсвязывающих белков: профилином, изолирующим мономеры актина; гельэолином, виллином, северином, разрывающими ("разрезающими") актиновые фгшаменгы; а-актинином, сшивающим актиновые филаменты между собой (Рп)гщп! е! а1., 1994; )апшеу, 1994, 1998). Взаимодействие актин-связывающих белков с Р1Рэ обычно способствует полимеризацни актина, в то время как связывание этих белков с Сам приводит к деполимеризации актиновых филаментов. Таким образом, снижение уровня Р1рэ в совокупности с увеличением (Са ); способствует деполимеризации фнламентов (1,ее, К1гее, 1995).

В опытах и тйго показано, что Р1Рз прочно связывается с профнлином (мол. массой !2-15 кДа), что приводит к диссоциации комплекса профилина с актином, освобождению мономеров актина и полимеризацин акпшовых филаментов (Аг)егер, 1992; 1.ее, Клее, 1995). В интактных клетках профилин прочно связан с Р!Рэ и не участвует в перестройках цитоскелета. Кроме того, Р1Рэ, связанный с профилином, не доступен для гидролизующего действия различных изоформ ФЛС.

Обнаружено, однако„ что при активации рецепторов с собственной тирозннкинвзной активностью (рецепторов ЭФР, рецепторов фактора роста тромбоцитов) и прн фосфорилированин по тирозину ФЛС-Т1, фосфорилированная ФЛС-у! может вызывать гидролиз Р!рз, связанного с профилином (Оо! бзсйш)гй-С!еппоп! е! а1., 1991). В лейкоцитах (в частности в мвкрофагах) основным актинсвязывающнм белком является гельзолин (мол. масса 90 кДа) (Ре!бй Гау, 1998). Ультраструкэурные иммуногнстохимические данные свидетельствуют о том, что в макрофыах и тромбоцнтах гельэолин вэаимодействуеэ с плаэматнческой мембраной и мембранами з> внутриклеточньгк органелл (эидоплазматический рстнкулум, л>итохоидрии) (Нагм!8 е! а1., 1989).

Гельзолин связывается в мембране с Р!Р и препятствует гидролизующему действию ФЛГ (бвл е! а1., !997). 1)ри увеличении [Са ), до микромолярных значений гель>олин освобождается в цитоллазму и связывается с актиновыми филаме>лами (>Ране е( а)., 1997). В присутсгвии микромолярных концентраций Са гельзолин блокируез "оперенный", или быстро растущий, конец алтиновых филаментов и вызывает в конечном итоге фрагментацию филаментов (Нон>ап) ег а1., ! 990). Представляют интерес полученные в последнее время данные о том, что Р!Р> может прямо взаимодействовать с )р,-рецептором в мембране зндоплазматического ретикулума.

С использованием методики встраивания )Р,-рецептора в бимолекулярную липидиую мембрану, показано, что !Р;-рецептор из мозжечка крысы образует стабильный ингнбнторный комплекс с эндогенным Р! Рз ((.црн е! а)., 1998). Разрушение этого комплекса при действии специфических моноклональных антител против Р)Р> приводит к увеличению активности )Р>-рецептора и повышению его сродства к ! Р>. Добавление экзогенного Р)Р> приводит к блокированию связывания )Р> с рецепп>ром и ингнбироаанию активности 1Р,-рецегггора. Предполагают, что Р1Р> взаимодействует с 1Р>-связывающим участком (р,-рсцегпора. Авторы предлыают новый вариант модели сопряжения, в соответствии с которым !Р>-рецептор, расположенный в мембране эндоплазматического регикулума, прямо связан с Р(Р>, локализованным в плазматической мембране.

В нестимулированных клетках, часть 1Р>-рецепторов ингиблрована вследствие взаимодействия с Р1Р>, Стимуляция клеток агонистами вызывает активацию ФЛС, расщепляющей зту связь, что приводит к одновременному улалению ингибитора (Р(Р ) и продукции активатора (1Р>). Обрвзовавшг>йся 1Р> активирует ! Р;рецептор и индуцирует мобилизацию Са из дело ((.цро е! а!., 1998). В последние годы обнаружено также, что Р(Р участвует в регуляции активности К"-каны>ов входящего выпрямленна, управляемых О-белками, ко.горые, как известно, независимо активиру>стоя [)усубьединицами О-белков и внутриклеточнымн ионами На" (Ре61-)асцпез е! а)., 1999).

Установлено, что !)у-субъединицы и На' связываются с С- концевым фра> ментом канала и способствуют его взаимодействию с Р!Р (Ка>зсЫп, ! 999„Но. Мцгге!1-(.арпа>)о, 1999; 1.обо!Ьебз, 7!>ап8„1999: Ко)жсз ег а(., 1999). Для АРФ-чувствитсльньж К -каналов (имеющих характеристики входяще>о выпрямленна) также установлена модуляция фосфоинозитилал>и.

Г!оказано, что Р1Р> конкурирует с А!'Ф за связывание с каналом. уменьшает чувствительность канала к б>юкируюшему зз действию АТФ и стабилизирует озкрытое состояние канала (Еап. Ма)г1е!з)г), !999; Коглег ег а)., 1999). 4.2.3. Структура и регуляция протеинкиназы С Образовавшийся при гидролизс Р)Р 0ЛП активирует второй ключевой фермент фосфоинозитидного пути - протеинкинвзу С (ПКС).

В настоящее время ПКС обнаружена во всех исследованных тканях млекопитающих за исключением зрелых безъядерных эритроцнтов. а также в тканях других типов животных (Мз)лишка, 1984, 1986). В тканях млекопитающих идентифицировано 1! изоформ ПКС, которые подразделяют на 3 группы: классические (кПКС К новые (нПКС) и атипичные (аПКС) ПКС [74)з)з!гц)га, 1988, 1992, 1995).

Классические ПКС включают и, ()1, Д1! и у изоформы. В макрофагах крысы идентифицированы !) и Ь изоформы ПКС, относящиеся к кПКС и нПКС, соответственно (0)егег, Гпх(ге, ! 993). ПКС представляет собой полипсптидную цепь (670-690 аминокислот, мол. масса 77 кДа), состоящую из двух функционально различных доменов - регуляторного и каталитического.

)4-терминальная часз*ь регуляторного домена кПКС содержит два консервативных участка С! и С2, играющих решаюц!ую роль я регуляции активности ферменза. В нПКС и аПКС участок С2 отсутствует. С-термииальная часть фермента включает два дополнительных консервативных фрагмента СЗ н С4. Участок СЗ связывает ЛТФ, а фрагмент С4 отвечает за связывание белковых субстратов. Фрагмент С! содержит псевдосубстратную последовательность и два богатых цистеином и содержащих цинк пальцеобразных участков. Эту структуру называют цинковой бабочкой (Впс Ьццегйу), так как она связывает два атома цинка. Именно с цинковым пальцеообразным участком связываются 0АО и форболовый эфир. Фоагменнт С2 в регуляторном домене классических кПКС определяет чувствительность фермента к Са .