Крутецкая, Лебедев, Курилова - Механизмы внутриклеточной сигнализации - 2003, страница 10

Высокомолекулярная фосфолипаза Аз (кол. масса 85 кДа) в макрофагоподобных клетках линии 1774 является субстратом для фасфорилирования ПКС, активность ее увеличивается при обработке клеток форболовым эфиром ТРА (%!))гапдег, бгшг(1ег, 1991). Активность высокомолекулярных фосфолипаз Аз молулируется также С-белками. Так, в пермебилизованных лейкемическчх базофилах крысы активатор 0-белков ГГФ78 в 5-6 раз увеличиваез.

активность фосфолипазы А. и освобождение АК (!ч агав!гпЬап е! а1., 1990). Добавление ГТФ78 к нейтрофилам человека также увеличивает в 3 раза активность 85 кДа фосфолипазы А. (Апс1о е! а!., ! 992). Все вышеизложенное свидетельствует о важной роли высокомолекулярных фосфолипаз А цитозоля в рецепторзависимой передаче сигналов, освобождении АК и образовании эйкозаноидов.

Эффективным блокатором фосфолипаз А является 4- бромфенацилбромид (КоЬег!з е! а1., 1977; 1гя!пе, 1982; СЬап8 е! а1., 1987; Ст!взег е! а1., 1990; Нак!ец е! а!., 1990; Крутецкая, Лебедев, !993). 4- бромфенацилбромид необратимо модифицирует (алкилирует) остаток Н(я-48, входящий в состав алтивного центра фермента. В последние годы новая форма секреторных фосфолипаз Аз идентифицирована в тканях человека (СЬеп е! а1, ! 994а), крысы (СЬеп ег а1., 1994Ь) и макрофагоподобных клетках мыши линии Р38815, (Ва! Ьоа е! а1., 1996). Эти фосфолипазы Аз объединяют в Н группу. Эти секреторные фосфолипазы А. имеют мол. массу !4 кДа, 6 дисульфидных связей, 118 аминокислот, активируклся Са в миллимолярных концентрациях (!Зепи)з, 1997). В макрофагоподобньш клетках мыши линии Р388(уь являющихся моделью пернтонеальных макрофагов (С!азег е! а1., !990), обнаружена цитоплазматическая Са'-независимая фосфолипаза Аз с большой мол.

массой (80-85 кДа), ве содержащая дисульфидных связей, способная образовывать олигомеры с мол. массой 337 кДа (Асйеппапп е! а1., 1994, 1995). Эти фосфолипазы Аз относят к 1Н группе ((уегш!з, 1997). Таким образом, с каждым годом идентифицируются все новые фосфолипазы Аь играющие важную роль в процессах внутриклеточной сигнализации, освобождении АК и синтезе эйкозанондов. Во многих случаях, в одной н той же клетке присутствует несколько форм фосфолипаз А .

Так, в макрофагоподобных клетках линии Р388(уь обнаружены фосфолнпазы Аз, относящиеся ко П и 1Н группам, а также Са '-независимые фосфолипазы Аз Н! группы (ВагЬопг, !3епп)з, ! 993). АК, освобожденная из мембранных липнлов под дейп.вием фосфолнпазы Аз, легко окисляе гся с образованием биологически активных соединений эйкозаноидов. Эйкозаноиды являются важными медиаторамн во многих физиологических и патофизиологических процессах. Количество и специфичность синтезируемых простагландинов или лейкотриенов 47 зависнг не только ст оснащенности клетки ферментами„окисляющими АК ло соответствующих метаболитов, но и, более того, от типа используемого стимула.

По сравнению с другими клетками, макрафаги являются наиболее активными производителями всего спектра зйкозаэоидов. Они способны синтезировать и секретировать метаболиты АК в ответ на многие физиологические стимулы, такие как факторы, вызывающие фагоцитоз, нммунные комплексы, факторы комплемента, янпополисахариды, эндотоксин (Бсоц е! а!.„ 1980, 1982; Наппйоп, Адашз, 1987; Каекег е1 а!., 1990) и таким образом непосредственно участвую~ в воспалительных и аллергических реакциях. В перитонеальных макрофагах АК, освобождаемая из мембранных фосфолипидов под действием фосфолипазы Аз легко окисляется по циклооксигеназному и липоксигеназному путям (Бсоп е! а1., 1982; Тпрр ез а1., 1985а, 1985!э).

Резидентные перитонеальные макрофаги мыши освобождают большие количества свободной АК при стимуляции зимозаном, ксиканавалином А, кальциевым ионофором А 23187, или активатором ПКС форболовым эфиром РМА (ВаЫпбе е! а!., 1990). По эффективности стимуляции освобождения АК агенты выстраиваются в следующий ряд: А 23! 87» зимозан > конканаввлин А > РМА. Показано, что предварительная инкубация макрофагов в течение 1О мин с РМА существенно потенциирует освобождение АК при действии других аюннстов.

Культивируемые резидентные макрофаги крысы продуцируют небольшие количества свободной АК и простагланлина Ез (Резега-По)беп а а1., 1990). При стимуляции перитонеальных макрофагов в течение 30 иин активатором ПКС форболовым эфиром РМА (50 нМ) происходит существенное возрастание продукции свободной АК, продуктов се окисления по цикчооксигеназному пути 6-кетопростагландина Р,„, тромбоксана Вз, простагландина Ез, простагланлина Пв а также продулта 12-липоксигеназного пути окисления АК !2-гнлроксиэйкозатетраеновой кислоты. Способность РМА запускать метаболизм АК в перитонеальных ивкрофагах коррелирует с его возможностью активировать ПКС.

В пользу этого свидетельствуют следующие данные. Так, показано, что другой активатор ПКС, проникающий через мембрану аналог ПАП 50 мкМ олеоил ацетилглицерин также активирует метаболизм АК в леритонеальных макрофагах. В то же время, форбол дидеканоат, не способный активировать ПКС, не влияет на метаболизм АК в макрофагах. Более того, два структурно различных ингибитора ПКС стауроспорин и сфинганин предотвращают вызываемое РМА освобождение АК в леритонеальных макрофагах.

В то же время, инкубация с РМА ачьвеолярных макрофагов крысы не приводит к образованию эйкозаноидов, а сопровождается только продукцией незначительного коли <яства свободной АК (Регегз-Оо!беп е! а!., 1990). Обнаружено также, что активация ПКС запускает освобождение и метаболизм АК в различных популяциях макрофагов, включая моноцнты периферической крови человека (КохпгпЬо е! а)., 1987), резидентные перитонеальные макрофаги мыши (Ншпез е! а!., 1982; ЪЧеу„Вах!ег, 1986; Ргали)гпсйе е! а)., 1989), клетки Купфера (О!егег ег а1., 1939; Кшрег е! а!., 1989) и макрофагоподобные клетки линии КА% 204.7 (Впгсй, 1937). Практически во всех указанных популяциях макрофагов, также как и в пернтонеальных макрофагах крысы (Резега-Оо!деп ег а1., 1990), освобождающаяся при активации ПКС АК окисляется преимущественно по циклооксигеназному, а не по 5-липоксигеназному путям (Ншпея е! а1., 1982; %еу, Вах!ег, 1936; КохпшЬо е! а!..

1937). Так, в макрофагах печени крысы, обработанных РМА, АК окисляется до просгагландина Еь простагландина О, и тромбоксаиа Вз (Р(е!ег, Рйх!се, 1993), В резидентных перитонеальных макрофагах мыши и макрофагоподобных клетках линии НЛ 38, активаторы ПКС форболовый эфир ТРА и синтетические аналоги 1эАО диоктаноилглицерин и олеоилацетилглицерин стимулируют освобождение АК и продукцию просзагландина Ез, но не лейкотриена Ся (Каечег е! а!., 1990). Увеличение внутриклеточной конпентрацни Саз путем добавления Саз'-ионофоров олиовременио с активаторами ПКС приводит не только к образованию простагландина Ез, но н к активации 5-липоксигеназного пути окисления АК и продукции лейкотриена С,.

Ингибиторы ПКС сфингозин, тамоксифен, стауроспорин полностью устраняют эффекты ТРА (Каечег ег а)., 1990). Учитывая, что 5-липоксигеназа в большей с~сивин зависит от внутриклеточной концентрации Са'", чем фосфолипаза Аз (Адагеш, Сойп, 1938), а также то, что акгивация ПКС в общем ие связана с повышением (Са ), (Н(зЬ(ки)га, 1936), можно предположить, что отсутствие продуктов 5-липоксигеназного пути окисления АК при активации ПКС связано с неадекватным Са=-сигналом (ТНрр ег а1., 1935Ь). В перитонеальных макрофагах мыши окнслительный метаболизм АК активируется при действии противоопухолевого агента циклофосфамнда (циклофосфана, эндоксана) (О!отдало ег а1., 1988).

Циклофосфамид увеличивает освобождение продуктов циклооксигеназного (простагландин Ез) н липоксигеназного (лейкотриен Ся) путей окисления АК. Полагают, что этот эффект циклофосфвмида определяет его иммуномодулирующее действие (Оюгдапо ег а1., 1988). В макрофагоподобной клегочиой линии РЗ88О, основными продуктами циклооксигенвзного пути окисления ЛК (индуцированного липополисахаридом из Е.со)1, фактором активации тромбоцитов, мелитгином или Са" -ионофором А23137) являются просгагландин Оз и простагландин Е.

(1ля!ег е! а1., 1989; О!аяег е! а1., !990; ВагЬопг, Оепшз, 49 1993). Обнаружено, что в этих процессах участвует внекпеточиая фосфолипаза А. !1 группы (ВагЬоцг, Оеппай 1993). В пернтонеальных макрофагах крысы метаболизм АК активируется при действии препарата ОК-432, полученного из бдгер1ососсцз руойевез (1та1апаЬе е1 а!., 1992). Этог препарат является иммуностимулятором и эффективным противоопухолевым агентом. Показано, что в макрофагах ОК-432 стимулирует продукцию простагландина Е. лозозависнмым образом. Стимулирующий эффект ОК-432 на метаболизм АК подавляется ингибитором фагоцитоза цитохалазином В.

Однако ОК-432 не активирует клетки МОСК, не имеющие фагоцитарной активности. Это свидетельствует о том, что вызванная ОК-432 активация метаболизма АК связана, по-видимому, с фагоцнтозом частиц Ок-432 (жа1апаье ег а1., 1992). Представляют интерес данные о том, что ответы культивируемых мононуклеарных фагоцитов на приложение различных воспалительных сгимулов зависят от того, в каких условиях 1п чгко эти клетки находились Так, обнаружено, что резидентные перитонеальные макрофаги мыши при сняауляции их зимозаном продуцируют большие количества продуктов циклооксигеназного пути окисления АК простагланлина Е» и бкетопростагландина Еы (Нощез ег а1., 1980).

В то же время, перитонеальные макрофагн, полученные из мышей, которым прелварительно лелались интраперитонеальные иньекции воспалительного стимула, ~акого как тиогликолат, продуцировали значительно меньшие количества простаглаидина Е: и 6- кетопростагланднна Г, при воздействии зимозана. Обнаружено, что этн различия между резидентными и активированныьщ тногликолатам популяциями макрофагов могут быть обусловлены тем, что акгивированные макрофаги освобождают существенно меньшие количества АК в ответ на приложение зимозана по сравнению с резидентными клетками (Нцгпез ег а!., 1980). Клетки мононуклеарного рида, моноциты и макрофаги, способны образовывать лейкотриены наряду с другими биологически активныын молекулами, такими как простагланлины, ннтерлейкин-1, фактор некроза опухолей н др. (Напцйоп, Аг(агля, ! 987; Еаьэо!егге е1 а1., 1988).