Крутецкая, Лебедев, Курилова - Механизмы внутриклеточной сигнализации - 2003, страница 9

Активированные фагоциты также продуцируют большие количества свободной АК, предшественника эйкозаноидов, являющихся мощными медиаторами воспаления ((Чаед!ешап ег а1„!986). В макрофагах АК составляет 259о жирных кислот мембран (5соп е! а!., 1980). Несмотря на существование нескольких механизмов освобождения АК нз фосфолипидов мембран (!гч!пе, 1982; Р,апа, Но(о(п, !990; Кругецкая, Лебедев, 1993) полагают, что в фагоцитах АК освобождается из мембран в основном в результате прямого действия фосфалипазы Лз (Напп1топ, Аданы, 1987; 1 езйе е! а1., 1988; уг!)Калг)ег, бцпс)!ег, 1939; Ва!гйпде е! а1., 19г0, 1992).

Так, для перитонеальных макрофагов морской свинки показано„что при нейтралы<ых рН (6.0-7.0) фосфолипаза А. освобождает АК преимущественно из фосфатидилинозитола. При других значениях рН фосфолипаза А. освобождает АК предпочтительно из фосфатидилхолина иля фосфппщилэтаноламина «3Ь!Ьа!а е! а1., 1938). Внугриклеточная концентрация свободной АК очень мала, поэтол~у лимитирующей стадией биосинтеза эйкозаноидов является освобождение АК из фосфолипидов мембран (1гч!пе, 1982). В связи с этим, фосфолипаза А, считается важнейшим ферментом в патофизиологии макрофагов. Фосфолипазы А, являются Са '-зависимыми эстеразами„ 2+ специфически катализирующими гидролиз сложноэфирной связи между жирной кислотой (ЖК) и 1,2-диацил-З-зп-фосфоглицеридом в положении зп-2.

В результате образуются свободная ЖК и лизофосфолипид. В настоящее время фосфолипазы Аз образуют быстро растущее большое суперсемейство различных ферментов, продукты деятельности которых играют важную роль в процессах внутриклеточной сигнализации, синтезе зйкозаноидов илн фактора активации тромбоцитов, а также общем метаболизме липидов (()епп!з, 1994, 1997).

Ферменты, входящие в это суперсемейство, различаются по функции„локализации, регуляции, механизму действия, аминокислотной последовательности, структуре и роли в их регуляции двухвалентных катионов. Фосфолипазы А„ выделяемые из тканей млекопитающих, подразделяются на внутри- и внеклеточные. В соответствии со сходе~лом аминокислотной последовательности, известные фосфолипазы Л подразделяют на несколько групп (Репо!з, !994, 1997). Фосфолипазы Аз, относящиеся к традиционным 1, П и 1П ~руинам, явлаотся внеклеточными (секретируемыми), имеют низкую мал. массу (13-15 кДа), ! 25 аминокислот, высокое содержание дисульфидных связей (5-7), 10-14 остатков цистеина, активируются внутриклеточным Саз в миллимолярной концентрации, причем Са' необходим для их каталитической активности.

Для каталитической активности этих групп фосфолнпаз А. необходимы консервативные остатки Нж-48 и Лзр-99 (Окпп!з, 1994). Фосфолипазы Л. 1, П и ЬП групп не имеют специфичности к ЖК, расположенной в положении зп-2 глицерофосфолипида (Кгатег е! а)., 1989; 3!е1Ьашег е! а)., ! 989), инактивируются агентами, восстанавливающими дисульфидные связи, такими как дитиотреитол (Надаз е! а!., 1935). Фосфолипазы Лт 1, П и 1П групп активны в широкой области рН (7-10), устойчивы к нагреванию и воздействию кислот (ггж)аз е! а!., 1985). Эти фосфолипазы А предпочтительно высвобождают ЖК из фосфатиднлэтаноламина и ФС и значительно хуже гидрализуют фосфатидилхолин «Мауег, «ь!агзйай, 1993). В связи с тель что 14 кДа фолипазы Аз 1! группы присутствуют в синовиальной жидкости ьных ревматоидным артритом, предполагают, что эти фосфолипазы Аз аствуют в воспалительных процессах (Час)ая е! а|., 1985). комолекулярные фосфолипазы А, 1, !! и И! групп обнаружены в желудочной железе млекопитающих, ядах кобр и морских змей (1 ппа фосфолипаз А,); ядах гадюк, ямкоголовых змей, тромбоцитах овека н крысы, печени и селезенке млекопитающих, синовиальной кости больных ревматоидным артритом (11 группа фосфолипаз Аз)1 пчел и ящериц (!11 группа фосфолипаз Аз) (!зепи!к, 1994, 1997; Мауег, зЬаП, 1993; Крутецкая, Лебедев, !993).

Относительно недавно в цитозоле различных ~илов клеток аружены Са -зависимые фосфолипазы Аз высокой молекулярной сы, объединяемые в настоящее время в ~руину 15Г(Оепшы 1994, 1997). фолипазы А, этой группы являются цитоплазматическими, включаот аминокислот, 9 остатков цисгеинщ не содержат дисульфилных связей, увсгвительны к дитиотреитолу, имею~ высокую мол. массу (85 кДа) и |ифичность к АК, расположенной в положении зп-2 церофосфолипидов, Все высокомолекулярные фосфолипазы А, ивируются ш ей!го Са в субмикромочярных конценграциях (Оепп)з, 4„1997).

Фосфолипазы А, 1У группы идентифицированы в цитозоле лейкемических монолитов человека линии 13937 (С!аг)г ег а|., 1990, 1991; Июх, Мопй, 1990; Кгашег ег а!., 1991; Язагр ег а1., !991), резидентных перитонеальных макрофагов мьлпи (%!))гапдег, 5цпд!ег, 1989), макрофагоподобных клеток мышей линии ЙА1ч' 264.7 (1.еяйе ег а1., 1988; С)залпов, 1.езйе, 1990) и 1 774 (Ут'1)йаиг)ег, Бппгйег, 1991, 1992 ), тромбоцитов человека (Та)гауагпа ег а!., ! 991 ) и других типов клеток. Фосфолипаза Аз, идентифицированная в цитозоле перитонеальных макрофагов мыши, имеет мол.

массу 70 кДа, максимальную активность при 1,4 мкМ свободного Са, предпочтительно освобождает АК из фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина и фосфатидилинозитола. Активность этой фосфолипазы Аз увеличивается прн обработке макрофагов активатором ПКС форбшюаым эфиром РМА. Фосфолипаза А. в перитонеальных макрофагах активна в широкой области рН (7-10); при РН<б активность фермента резко падает. Фосфолипаза А. ингибируется нордигидрогуаретиковой кислотой, флввоноидом кверцетином и классическим ингибизиром фосфолипаз Аз 4- бромфенацилбромидом. 503Ь-ное подавление активности фермента наблюдается при концентрации 4-бромфенацилбрэмида, равной 15 мкМ (Ж1) !гапдег, бгшд)ег, 1989).

Г1редставляют интерес данные о том, что повышение внутриклеточной концентрации Саз инициирует в целых клетках транслокацию из цитозоля и связывание с мембраной высокомолекулярных фосфолипаз А. !С)заппогк Сея!!е, 1990; О)ех, Мопй, 1990; С1аг(г ег а)., 1991; 1ч))(сак1ег, Зонг!!ег, 1992). Показано, что Са' способствует связыванию цитоплазматических фосфолипаз А, группы 19 с фосфолипидами мембраны н не участвует в каталитической активности фермента (%13(ганг(ег, Вопд!ег, 1992; Оеппй, 1994).

На Х-терминальном и конце молекулы высокомолекулярные фосфолипазы Аз содержа~ Са связывающий домен, сходный с таковым в других сигнальных белках, таких как ПКС, ГТФаза-актнвирующий белок, ФЛС (С!агЕ ез а1., 1991; 51~агр ег а1., 1991). Г!рнсутствие Са -связывающего домена, а также зависимость активности фермента от субмикромолярной концентрации Са" (0,1-1 мкМ) (СЬаппоп, Ьез((е, 1990; С!аг(г е1 а1., 1990; Кгагпег ег а)., 1991) свидетельствует о том, что вызываемое агонистами увеличение (Са~ ), является важным этапом в транслокации фосфолипазы Аз к мембране. Для перитонеальных макрофагов мыши показана прямая корреляция между внеклеточной концентрацией Са, т.е.

возможноспю входа Саз в клетку, и активностью фосфолипазы Аз. Это позволило лредположитгч что рецепторзависимый вход Саз в макрофаги играет существенную роль в активации фосфолнпазы Аз (ВаЫпг(е е1 а1., 1990). Сходные данные получены на других фагоцнтируклцих клетках аердрофилах человека (КесЫу ег а!., 1995), а также на клетках глиомы ярысы (Вгоо)сэ е! а(., 1989). Интересно, что дру~ие двухвалентные ионы (Ва, Мп, бгэ, Мдз ), а также высокие концентрации 14аС! или 1Ча ЯО, могут с успехом заменять Са и активировать высокомолекулярные фосфолипазы А, (1Ь1)(ганг(ег, Звпд)ег, 1992; Кеупо!г)з е! а1., 1993; Оепппй 1994). Так, в присутствии высокой концентрации соли и в отсутствие Са наблюдается повышение эазиматической активности, мо подтверждает предположение о том, что аон металла или соль скорее способствуют связыванию фосфолнпазы А.

с иембраной, нежели изменению каталитнческой активности фермента (йеуло)дз ег а!., 1993). Обнаружено, что для каталитической активности этих фосфолипаз А, необходимы специфические остатки бег-228, Агй-200 и Аэр-549 (8Ьагр е! а1, 1994; Р)с1гагд ег а!., 1996). В последнее время появились данные о том, что активность цвтоплазматических фосфолипаз Аз гт' группы эффелтивно модулируется фосфорилнрованием (1йп ег а1., 1993; Мауег, МагзЬа(1, !993; ЫеглегюГГ ег я1.. 1993; Оепшз, 1994). Фосфорилпрование этого фермента ш Мво приводит к увеличению освобождения АК, а также к некого!юму увеличению активности )п ч)цо. Обнаружено, что Зег-505 в молекуле фермента фосфорилируется серии-треониновыми киназами: ПКС н прстеинкиназой, связанной с микротрубочками (р42 МАР-киназой) (!йп ег з)., !993: )чепэепо1Т ег а1., 1993).