Крутецкая, Лебедев, Курилова - Механизмы внутриклеточной сигнализации - 2003, страница 4

Вышеизложенное свидетельствует о том. что жесткая локализация > АЦ в мембране лает ей возможносп, быстро н избирательно реагировать на вход Са в клетку. Регуляция активности АЦ внутриклеточным Са зв позволяет клетке ингегрировать активность двух основных втори шых мессенюкеров, цАМФ н Са В последнее время появились данные о том, что концензрация цАМФ может регулироваться внеклеточным Са в физиологических концентрациях.

Так. показано, что Са -ипгибирусмая АЦ У) типа функционально колокализоваиа в клетках почки крысы с рецептором, чувствительным к виеклеточной концентрации Са ' (Репе(га е1 а).. 1998). 4.1.2. Структура и регуляция протеинкинязы А Второй ключевой фермент аденилатциклазного пути передачи информации, протеинкиназа А (ПКА), идентифицирована во всех ~канах млекопитающих. В отсутствие цАМФ, ПКА представляет собой неактивный тетрамер, состоящий из двух регуляторных (К) и двух каталитических (С) субьединиц и имеет четвертичную структуру КзС, (Ггапспй СогЬ!п, 1994). Показано, однако, что ш Мпо ПКА может функционировать как димер, состоящий из одной К и одной С субьединиц.

При связывании двух молекул цАМФ с одной К субьединицей, сродство К и С субьединиц уменьшается в 10000-100000 раз и теграмсрная ПКА диссоциирует на димер из двух К субьедииьнз и две мономерные С субьедииицы, фосфорилирующие различные белковые субстраты. Регуляторная К субьединица (мол. масса 43-45 кДа) имеет следующие функциональные домены, начиная с )ч-конца молекулы: домен, участвующий в днмеризации субьединиц; домен, содержагций участки аутофосфорилирования; два домена, связывающих цАМФ с низким и высоким сродсгвом, соответственно; С-терминальный домен. У млекопитающих идентифицированы две основные изоформы К субъединицы — И и И! (Ггапсий СогЬ(п, 1994). Каталитическая С субьединица ПКА представляет собой глобулярный белок с мол, массой 40 Яа (350 аминокислот), миристоилированный на Ь)-конце.

Далее расположены: домен, связывающий Мй /АТФ( домен, взаимолействущий с белковыми субстразами, и обеспечивающий каталитическую функцию; С- терминальный домен. Активированная С-субьединица в присутствии Мй /АТФ катализирует перенос у-фосфата с АТФ на различные белковые субстразы, содержащис последовательность аминокислот — Агй-Агй-Х- Бег/ТЬг-Х- (Кение)у. КгеЬз. 1991; Гщпспь Согб)п, 1994) Показано, что для каталитической активности Г-субьединицы важны 3 аминокислоты (Азр.

!бб, Суз-!68 и Азп-!71). которые являются консервативными во всех протеннкнпазах, фосфорплируюших белки по остаткам серила плн м треанина. У млекопитающих илентифнцированы 3 нзоформгл С субьсднницы: а, () н 7 ! Ргапс!з, Согб!и, 1994). Фосфорилированне белков является одним нз основных способов перелачи сигналов, контролирующих различные клеточные процессы. В соответствии с этилп активность протеиньнназ и фосфатаз должна жестко регулироваться.

Один из уровней регуляции заключается в определенной субклегочной локализации киназ и фосфатаз путем взаимодействия нх с определенными «заякорнвающими белками», что способствует быстрой и избирательной модуляции специфических мишеней в определенных микродоменах клетки в ответ на растворимые вторичные мессенлжеры (Ре!! 'Асг)ца, Ьсо!г, 1997). Так, обнаружено, что во многих тканях значительная часть ПКА. главным образом протеин«ни«ты типа П, расположена в определенных доменах клетки благодаря взаимодействию регуляторных КП субьединнц с соответствующими «заякориваюшими белками», которые были названы АКАРз (Соб)з)ап ег а!., 1995; Пей 'Асг)цгч усоп, 1997).

Каждый заякориваюшнй белок содержи~ два типа связывающих участков: консервативный «заякоривающий фрагмент». который связывает К субьединицу ПКА, и домен, который определяет субклегочную локализацию комплекса ПКА-АКАР путем взаимодействия со сзруктурными белками, мембраиамн нли клеточными органеллами. Показано, что для связывания с АКАРз важны остатки изолейцина в положении 3 н 5 КП субьединицы ПКА. Иммунохнмическими методами илентифнцированы АКАРз, связанные с центросомами (АКАР350)„ а«типовыми фнламеитами (АКАР78 или ззрин; АКАР250), зндоплазматическим регикулумом (АКАР!00).

аппаратом Гольдин (АКАР85), митохондриями (АКАР84), плазматической мембраной ! А КА Р!5) ()3е!1 'Асг(ца, 8сог(„1997). Важность заякорнвання ПКА с помощью АКАРз установлена ддя потенциал-зависнмых Са -каналов 1 -типа нз скелетных мышц, активность которых увеличивается при фосфорнлировании ПКА (Огау е! а!., ! 997; Сапега!1, 2000). С помощью биохимических и иммунологических методов показано, что Са'-каналы 1.-типа выделяются из скелетных мышц вместе с ПКА и заякорнвающим белколз АКАР15. Это свидетельствует о том, что АКАР)5 обеспечивает заякоривание !'1КА околоСаз-:канала Са -каналы 1:типа из клеенок гладких мышц сосулов также «юсфорнлируются ПКА, заякоренной с помощью специфического белка АКАР (Ейопй ег а!., 1999).

Стимулирующее депсгвие ПКА на Са '-каналы ) страняется пептидом Нг 3 1, ннгнбирующим связывание ПКЛ с АКАР. !)1- и ()2-адренергнческие рецепторы в клетках серлца модулируют активность Га -каналов Е-типа. активнруя ПКА. заякоренную с помощью белка АКАР15 ! Капзр. Не!!. 2000) Для потенциал-зависимых (ма -каналов из клеток мозга также обнаружено, что АКАР15 заякориааег ПКА около Иа -каналов (Т(ЬЬз ег а!., 1998). В последнее время обнаружены мультивалеитные АКАРз, которые одновременно связывают не только ПКА, но н другис ферменты. Предполагают, что зги АКАРз служат участками сборки сигнальных комплексов, состоящих из нескольких киназ и фосфатаз.

Так, в нейронах ' ПКА локализована в области постсинаптическнх уплотнений благодаря взаимодействию ее регуляторной субьединицы с АКАР79. Г!оказано,что 1 АкАР79 связывает также фосфатазу 2В (кальцинейрин) и пратеинкиназу ~ С (Собй(ап е! а(., 1995; Пей Асс(ца, 8соп, 1997). Таким образом, АКАР79 координирует локализацию трех сигнальных ферментов в области постсинаптическик уплотнений, Потенциальными мишенями для этого сигнального комплекса могут быть каинатныс рецепторы или Са'- каналы, которые могут модулироваться ПКА, а также ГчМОА рецепторы, которые аьтивируются протеинкииазами А или С и ингибируются фосфатазой 2В.

' В мегакариоцитах человека идентифицирован АКАР250 или гравии, связанный с актиновыми фнламентами. Обнаружено, жо АКАР250 содержит связывающие участки для ПКА и протеинкиназы С (Г(еП 'АСцца, Бсоц, 1997). Можно предположить, что сигнальные комплексы, включающие АКАРз, определяют специфичность действия цАМФ путем комцартментализации ПКА не только с фосфатазами, но также и с фосфодизстеразами, отвечающими за выключение сигнала.

Таким образом, вышеизложенное свидетельствует о высокой степени пространственной организации компонентов аденилатциклазной системы. 4.2. Фосфоииозитидный путь передачи сигнала Роль мембранных фосфоинозитилов в передаче сигнала изложена в многочисленных обзорах (ВеггЫйе, 1984, 1987, 1993; Вегги(бе, 1гт)пе, ! 984, 1989; Крутецкая, Лебедев, 1992а; Лебедев, Крутеикая, 1994; Крутецкая, Лебедев, 2000а).

д,р о сп х д о а, о И а-й ф* ооохао~ъ й.й( аад ~ О хоай х й ж о Р И „о ж о ~ аао а а о ~а а к а а Оов х о ~ ж 2 ж, о, ао «'-о*а, о Е ». а -А .«,.« «э„а, а о О3 а го Х Х о о а а «м оа„.аааД ахова~- о«о оа~ .й "РаЙ""я ас«Я — ж $ д;с -е оо, .-~ «~р а о ц аа аа "ооО4„о о о Ф х Ф а о 1„-2-,~„.. яс а., "~о о«. о „аО ы Й а. а о о~ о 2 а а о< а«о Р'о о =а о Оа яао о „х ~ х а 2 «- «~' к о о ы д о аж о, э >, Ю о а й ~ а о а о о оохоц~да«-л ,о ~а а а о о о о Ф ~ ~ ~ ~ х Й д а а а х о 9 > «-.Е ««о ж о.о .

о х о ж ж ы ~. «о ь 5 о а ~«р о «- а, о,1«.о 3 -Юо о И ц«« ~ х и«~'Ц ~~ ы«-~ а о ~ ~ о ~ ф Внешний сигнал после взаимодействия с репспторбм через О-белок активирует усилительный фермент фосфолнпазу С (ФЛС) (рис. 10). Ф)!С расщепляет мембранный фосфолипид фосфагидилпнозитол-4,5-дифосфат (Р1Р.) иа два соединения, сл)оквщие внутриклеточными мессеиджерами: водорасгворимый ннозитол-1,4,5-трисфосфат (!Рз) и липндорастворимый диацнлглицерии (ОАО) (ВепЫке. 1993) (рис.

11). нвВВвзв внеявгвпе сз СМояы Лввяпванвяяя о .г, ~'~ ~, . о ПИ емяяея иьояввазкядмюмви. О СН вЂ” Π—:Р— О' :1 !з 11 — Р— О ! сг Л .л%.. ои, --он ! О-)я — 0 ! о О й — и — ю 1 О Омстяауаеня (олй) о" -у -"ю Кзоя1ьй-3 л,аатв)ДЯЯВРВЯЗЯ ()няня) Рнс. 11.

Образование ннозитол-1,4,5-трифосфатв и дивиилглицерина. Фосфолипаза С (рйозр)юйразе С1 катализирует гилролиз фосфатидилннозитол-4,5-дифосфата (Р1Р ) с образованием инозитол- 1,4 5-трифосфата (!Р,) и диацилглиперина (ОАС). 15 Клеточные рецепторы, ответственные за мобилизацию Са 22 взаимодействуют с особым С-белком (Сч), активирующим ФЛС и, слеловательно, образование 1Р2 и РАС. С„действует по тому же принципу, что и С-белки, регулирующие активность АЦ ()4еег, !995). Гидрофильный 1Рз диффуидирует в цигог2лазл2у н вызывает освобождение кальция из внутриклеточных депо (зндоплазматический ретикулум, митохондрии) Ионы Са образуют комплекс с Са -связывающим белком 'квльмодулином.