Фогель, Мотульски - Генетика человека - 1 (947311), страница 61
Текст из файла (страница 61)
Морфологические маркеры хромосом. Пары или кластеры сцепленных аутосомных генов (группы сцепления) невозможно соотнести с конкретными хромосомами на основе использования только формально-генетического анализа родословных. Впервые собственно локализация гена в определенной хромосоме у человека была осуществлена следующим образом !629; 855). В длинном плече первой хромосомы у человека час~о обнаруживается вторичная перетяжка вблизи цснтромеры. Примерно в 0,5'4 случаев в популяции эта перетяжка оказывается намного тоньше и длиннее, чем в норме.
Такие варианты наследуются доминантно. Если один нз гомологов первой пары хромосом обнаруживает аномальный фенотип, то предполагается, что он несет аллель (фактор деспирализации). Имеются данные о тесном сцеплении между локусом группы крови Даффи и покусом (3п-1: 0 = 0,05. С другой стороны, ранее было установлено сцепление между локусами Даффи и врожденной очаговой катаракты (11620), Следовательно, группу сцепления из трех локусов: катаракты, Даффн и Оп-! можно соотнести с первой хромосомой или «приписатья ее к этой хромосоме.
Другая возможность локализации гена на конкретной хромосоме связана с анализом делсций. Например, если ген, для которого известна доминантная мутация, оказывается утерянным вследствие делеции, то отсутствие этого гена может детерминировать фенотнп, сходный с тем, который обусловливает доминантная мутация.
Когда делеция достаточно велика по размеру и захватывает участки, смежные с данным локусом, можно ожидать, что в 3. Формальная генетика человека 199 фенотипе будут представлены дополнительные симптомы. В !963г. у умственно отсталого ребенка с двусторонней ретинобласгомой была обнаружена делеция в длинном плече одной из хромосом группы О (15311 (как выяснилось позже — хромосомы 13). Деления 1Зо14 была найдена и в ряде других случаев с ретинобластомой н дополнительными аномалиями. У больных ретинобластомой без дополнительных симптомов делеция обычно не наблюдалась.
Из приведенных фактов следует, что локус ретинобластомы относится к хромосоме 13. Другой, по-видимому чаше используемый. подход основывается на количественном исследовании ферментативной активности в случаях с хромосомными аномалиями. Болъшинство ферментов характеризуются четко различимым эффектом дозы гена, т.е. гетерозиготы по ферментативной недостаточности обнаруживают примерно 50;~ь-ную ферментативную активность. Сходный эффект дозы гена можно ожидать и в том случае, когда ген теряется вследствие делеции. Такой подход к картированию использовался для большого числа генетических маркеров. Чаще всего результат оказывался отрицательным, но такого рода кнсключаюшее картирование» полезно тсч, что может сузить область вероятной локализации генов-маркеров. Следует, правда, учесть, что на основе этого подхода были сделаны и неправильные выводы, поскольку наличие кмолчащего» (нулевого) аллеля, т.е.
непроявляющейся мутации, может имитировать эффект делеции. Если верно„ что гетерозиготы и моносомики обнаруживают эффект дозы гена, то вполне реально ожидать наличие такого же эффекта н у трнсомиков. Первые исследования активности ферментов прн синдроме Дауна (трисомия по 21-й хромосоме), казалось бы, подтвердили такой вывод. Однако, чем больше ферментов включали в анализ, тем больше среди них обнаруживали таких, которые следовало бы отнести к 21-й хромосоме (активность большинства изученных ферментов оказалась повышенной). Кроме то~о, у больных с синдромом Дауна обнаружилось неожиданное увеличение активности Х-сцепленного фермента О6РО. Отсюда следует, что количествен- ные изменения ферментативпой активности у трисомнков (п Иго могут быть связаны с нарушениями регуляции активности генов, локализованных в разных хромосомах.
Тем не менее все большее число случаев эффекта дозы генов описывается для трисомных и моносомных клеток, культивируемых (п чпго 111853 (разд. 4.7.4.3). Остановимся лишь на одном примере. Активность фермента фосфорибозил1 лицинамндсннтетазы (ОАйЯ) изучалась в нескольких случаях частичной моносомни и частичной или полной трисомии 21. Этн исследования были стимулированы предшествующими данными о наличии эффекта дозы гена для этого фермента. При регулярной трнсомии коэффициент превышения по отношению к норме составил 1,55. В других случаях соотношения были; 0,99 для моносомии 21с)21 — 21 ргег; 0,54 для 21о22- 21е(гегмоносомии; 0,88 для 21г)21 — ~ 2!р1ег-трисомии и 1,46 для 21г(22,1-трнсомни.
Анализируя эти данные, можно прийти к выводу о возможной локализации гена ОАВБ в субсегменте 21022.! (322]. Некоторые другие примеры приведены в табл. 4.27 и приложении 9. Использование разных вариантов хромосомной морфологии (таких, как упомянутая выше вторичная перетяжка на хромосоме 1) и эффекта дозы гена для картнрования-путь медленный и недостаточно надежный. Новый метод картирования, основанный на гнбрндизапни клеток, привел к болъшим успехам в этой обдастн.
3.4.3. Аннлиз сцепления у челонеккс гибрилизнция клеток и ДОК-технология Слияние клеток: лереые наблюдения. История открытия этого феномена описана Харрисом [702; 6923. Еще в 1838 г. Мюллер наблюдал двухъядерные клетки в опухолях, впоследствии Робин обнаружил их в костном мозге, Рокитански .при туберкулезной инфекции, а Вирхов †к в нормальных, так и в опухолевых тканях, Вывод о том, что двухъядерные клетки образу|отея в результате слияния одноядерных, был сделан в работе де Бари (1859). Он обнаружил, чго в жизненном цикле определенных мик- 200 3. Формальная генетика человека сомицетов происходит слияние отдельных клеток и формирование многоядерных структур.
Самые ранние сообщения о многоядерных клетках в поврежденных тканях, появление которых можно было бы определенно приписать действию вируса, принадлежали Лугинбюлю П873) и Вейгерту (1874), наблюдавшим такие клетки на поверхности оспенных гнойничков. Разработка методов культивирования тканей 1п хпго дала возможность часто наблюдать феномен слияния и уже к 1927 г. в 21-ой работе имелись ссылки на такие наблюдения. Было обнаружено (Епбегз, РееЫез, 1954), что слияние клеток в культуре ткани и формирование многоклеточных синцитиев может индуцировать вирус кори. В 1958г. Окада показал, что опухолевые клетки животных быстро сливаются и формируют многоядерные гигантские клетки при культивировании в жидкой среде в присутствии высоких хонцентраций вируса НЧЮ (из группы параннфлюэнцы).
В 1960г. Барски с сотр, в смешанной культуре опухолевых клеток двух разных, но родственных линий мышей идентифицировали клетки, возникшие в результате спонтанного слияния. Этн клетки содержали внутри единственного ядра хромосомные наборы обеих родительских линий. Позже группа исследователей во главе с Эфрусси пришла к выводу, что гибриднзоваться могут не только клетки близко- родственных линий мышей, но и линий с более выраженными генетическими различиями. Однако выяснилось, что частота спонтанного слияния клеток очень низка, а клетки многих типов спонтанно вообще никогда не сливаются и этот процесс необходимо индупнровать.
Кроме того, для накопления гибридных клеток при культивировании онн должны обладать селективным преимуществом. Вскоре обе проблемы были решены. В 1964г, Литтлфилду удалось выделить из смешанных культур встречающиеся с очень низкой частотой продукты спонтанного слияния. Для этого он воспользовался методикой, широко применяемой в генетике микроорганизмов.
При слиянии двух клеток, характернзуюшихся недостаточностью по двум разным ферментам, возни- кали гибриды, обладающие полным набором ферментов и способные расти на среде, лишенной соответствующих пишевых добавок. Харрис и Воткинс (1965) 12541 повысили частоту слияния различных клеток путем воздействия вирусом Сендай, предварительно инактивированным ультрафиолетом. С помощью этого метода им удалось показать, что слиться могут клетки самых разных видов организмов и что слившиеся клетки жизнеспособны.
С этой работы началось широкое использование метода гибридизации клеток в различных областях клеточной биологии. Утрата хромосом в гибридных клетках человек-мышь и отнесение гена к определенной хромосоме. Вейс и Грин (1967) Г9383 гибридизовали анеуплоидную мышиную линию клеток (подлинию мышиных Ь-клеток) с диплоидной линией человеческих эмбриональных фибробластов. Клетки мыши были мутантны по покусу тимндинкиназы (ТК) и не росли на среде НАТ.
Таким образом, среда НАТ была селективной, на ней отбирались клетки, содержашие ТК- покус человека П8830). Два типа клеток смешивали и вырашивали в стандартной среде. Через четыре дня культуры помешали в селективную среду НАТ. При этом мышиные клетки дегенерировали, и в культуре оставались только клетки человека.
Через 14-21 день на монослое человеческих кдеток можно было выявить гибридные колонии. Несколько таких колоний изолировали и выращивали более продолжительное время. Их клетки в основном сохранили хромосомиый набор мыши, а 75 — 95',г человеческих хромосом были утрачены. Однако почти во всех клетках, выращенных в среде НАТ, присутствовала одна человеческая хромосома. Была выдвинута гипотеза, что ген тимидинкиназы расположен именно в ней. Для проверки этой гипотезы контрольные эксперименты проводили на среде, содержащей Вгб1) (бромдезоксиуридин) — аналог тимина, распознаваемый тимидинкиназой и способный поэтому включаться в ДНК вместо тимина, что приводит к отбору против клеток, содержащих этот фермент, Ту хромосому, которую по харак- Мигов ! Хромосома17 тк Рнс.
3.16. Принцип локализации гена на аутосоме. Мышиные клетки, дефицитные по тимидинкиназе (М, ТК"), выращивают в смешанной культуре с нормальными клетками человеки (Н, ТК*). Клетки сливаются спонтанно, под действием химических агентов или с помощью вируса Сендай. Образовавшиеся гибридные клетки че- терной морфологии выявляли почти во всех НАТ-культурах, ни в одной из Вгд()- культур обнаружить не удалось. Авторы сделали вывод о том, что ген ТК действительно расположен в этой хромосоме.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
