Пташне - Переключение генов - 1988 (947309), страница 19
Текст из файла (страница 19)
1.12 (репрессор связан с О 2), 1.13 (репрессор связан с Оа!) и 1.14 (репрессор связан с 0„3). На рис. 4.!9 представлены бактернальные шгаммы, специально сконструированные нами для проведения ~акого анализа. Вначале мы выделили участок ДНК, содержащий оба промоэора, и присоединили к одному из его концов ген (ис У., лишенный собственного промотора. Продукт гена !ас 2, (3-галактозидаза, можно было легко обнаружить.
В одном штамме транскрипция lас 2 начиналась с промотора Р„н (рис, 4.19, А), а в другом -с промотора Р, (рис. 4.19.Б). Исходная конструкция содержала оператор Ок дикого типа, в других случаях присутствовали только один или два функциональных участка 1вв гес-репрессор — 3 — й — ~ Яф 1ае к ) ~вкп~ иптг гас- репреесор (,1 иптг Рис.
4.19. Бактернальные штаммы, сконструированные для анализа действия изолированных операторных участков. Оба типа клеток содержат плазмиду„ обеспечивающую синтез и-репрессора под контролем 1щ-репрсссора. Кроме того, клетки А содержат конструкцию Рхи-гасУ., а клетки Б Ра-1исК. Чем болыпс ИПТ1 добавлено в среду, тем болыпе Х-репрессора образуется. Уровень р-галактозизгазы в клетках обоих типов, растущих при различных концентрациях ИПТГ, показывает, как каждый из промоторов отвечает иа различные концентрации и-репрсссора. Ор обозначает 1ас-оператор, который вместе с 1ас-промотором был встроен перед ганом с1 связывания репрессора, а активность других участков была подавлена с помощью мутаций.
Клетки обоих типов, предсгавленные на рис. 4.19,А и Б, содержали также в составе плазмиды ген, кодирующий ).-репрессор, причем концентрацию репрессора можно было варьировать. Плазмида несла ген с), транскрибируемый с промотора )ас (Р!ас), и ген (аг-репрессора !ас!, продукт которого выключае~ )ас-промотор. Количество ).-репрессора, сиьп ез которого детерминируется этой плазмидой, можно регулировать, добавляя ИПТГ. Данное соединение инактивирует )ас-репрессор.
в результате чт о снимается репрессия !пг-промотора и синтез ).-репрессора увеличивается. В обычных условиях репрессор и белок Сто, которые начинают синтезироваться с промоторов Р и Р, соответсгвенно, влияют на активность промотора по механизму обратной связи. Однако в наших экспериментах 13-галактозидаза не оказывала влияния ни на один нз промоторов, устраняя тем самым сложности, связанные с регуляцией по механизму обратной связи.
Таким образом, этот подход позволяет выяснить, как действует связывание рецрессора с различными участками в составе 0» на промоторы Р„и Р „. Из рис, 4.20 видно, что при низкпх концентрациях ).-репрессора активность промотора Р„„повышается, а при высоких падает. Далее, по мере того как репрессор включает транскрипцию с Ран, он коордипированно выключает транскрипцию с Рк, причем подавление активности Ря в два раза от максимального значения происходит при такой концентрации репрессора, когда Р „наполовину активирован. Максимальная активация Р наблюдается при такой концентрации репрессора, какая обнаруживается в лизогенных клетках.
При этом активность Ра подавлена более чем на 99"1, В каком порядке должны заполняться участки 0„, чз обы вначале произотпло включение Р „и выключение Р„. а зазем выключение Р 2 Для ответа на этот вопрос были проведены эксперименты, гюдобные представленным на рис. 4.20, но теперь ).-операторы несли мутации в двух операторных учасзках каждый. Эти мутации подавляли связывание репрессора с поврежденными участками, но промоторы оставались неповрежденными. Это позволило изучить эффект связывания репрессора только с одним из участков. Резулыаты можно суммировать следующим образом. ° Ок2 Ок3 . Репрессор, связанный с Ок!, выключает Ра, но не активирует Р !рис.
4.2!,А). ЭО 1 0„2 . Репрессор, связанный с 0„3, не может ни активировать Р „, ни подавлять Р !рис. 4.21, Б). ФОа! 0 3 . Репрессор, связанный с Ок2, активирует Р „и подавляет Р„!рис. 4.21, В). В табл. 4.2 суммированы данные об активности промото- о ч 6 1:31:31:2 1::!ИИ Ива 3 т 1 3 ? 1 3 т 1 Канаентрання реарессара Рис 420 Регуляторное действие рспрессора ш тюо На этом графике сум мированы рсзузьтаты опьпов с клетками двух типов, изображенными на рис 4 19 Н обоих случаях измеряли количество !1 газактозидазы образую шейся при р~зной концентрации ИПТГ Середины кривых репрессии и активации приходятся на одну и ту же концентрацию ИПТГ т е соответствуют одной и той же концентрации рспрессора 1Сонцентрация репрессора, необхозимая для максимачьной активации Р„„, примерно соответствует уровню лоторый обнаруживается в лизогене Прямоугольники в нижней части рисунка т с тонно изображают состояние каждого операторного участка при различных концентрациях репрессора Темные прямоугольники соответствуют занятым участкам ров Р и Р„в случае, когда репрессор связывается с одним операторным участком Внимательное рассмотрение кривых на рис 4 21 позволяет хвидеть результат кооперативного связывания репрессора с соседними участками Например, хотя связывание репрессора только с 0„2 активирует Р и подавляет Ра, для такой активации и репрессии в случае мутантных 0„! и 0„3 треоуегся больше репрессора Объясняется это тем, что мутация зсграняет вспомогательный кооперативный эффект репрессору приходится связываться с Оа2 без «поддержки» со стороны репрессора, связанного с 0 1 Еще сильнее проявляется кооперативный эффект в том сзтучае, когда эксперимент, проиллюстрированный на рис 4 20, проводят с оператором, у которого участок Оа! несет мутацию, а Ок2 и ОК3 являются участками дикого типа В этом эксперименте исйользуют мутантный промотор, присоединенный к гену 1ис2, его обозначают Р !гр — ! Оп эффективно работает в отсутствие репрессора С помощью этого мутанта легко оценить негативное и позитивное действие репрессора на активность Р Рис 4 22 иллюстрирует удивительный результат такого эксперимента при концентрации репрессора, лишь слегка пРевышающий тУ, что пРиводит к актиеиггии Рк„в случае оператора дикого типа, происходит репресс.ия промотора в случае Оа1 111 Д В в и ИНЕЛ ННЕ3 ИНЮ зг!зг!зг е ЕЛИН ЕЛИН %НИ '5 2 1 3 2 ! 3 2 ! й $ НЕЛИ НСЛН НИН 3 2 ! 3 2 ! 3 2 1 концентрация реярессора — и Рис 4 21 Регутягорное действие оепрессора.
связанного с единственным но!загорным участком ~п мто Эти кривые суммируют резучьтать зкс перпмснтов полобных тем что проиллюстрированы на рис 420 за ись1н~чснисм того что здесь использованы м)тантные операторы Кривьтс описываю! влияние на активность промоторов Р„и Р„„связывания ре прсссора с Оя( (А) Оиз (Ь) и О„г (В) Прямоугольники с кресзами означают что соответствуюптис операторные участки содержат мутацию и не могут связывать репрессор Серые прямоугольники участки частично занятые реп рессором черные прямоугольники — почносгью занятые участки Можно было бы думать, что в результате мутации 0„1 увеличивается сродство репрессора к Ок3, однако на самом деле наблюдаемый эффект объясняется альтернативной попарной кооперативностью При связывании с 0„! репрессор взаимодействуег кооперативно с 0„2 и Он3, поэтому Он3 оказывается заполненным при такой концентрации репрессора, при которой он был еп(е свободен в составе оператора 112 Таблица 4 2 Результат свазывания лимера репрес- сора с единственным участком О».
Н отсутствие РепРессоРа Рки выключен (не активиРован), 4 Р» включен (верхняя строка) Р»и 0«3 0»2 О» ! Р» Выкяючен Выключен Включен Выключен Включен Выключен Выключен Включен х х П! л!'.Е) СХН ИИБ 3 2 ! 3 2 1 3 2 ! Конаентрааия реаресеора Рис 4 22 Альтернативная пои»рная кооперативность »п юто Эксперимент аналогичен представленному н ! рис 4 21. но здесь исследовано влияние на активность промоторов Р» и Р»ипр 1 связывания репрессора с 0»2 и 0»3 !!3 дикого типа. Как и следовало ожидать, этот эксперимен! показывает также, что при связывании репрессора с 0„2 и Ок3 происходит выключение Рк. При этом гребуегся меньше репрессора, чем если интактным остается ~олько Ок3, благодаря вспомогательному действию кооперативного связывания с 02и03. Результаты этого и других подобных экспериментов !и у!уо, в которых исследовали действие репрессора при связывании с операторами„имеющими один, два или три функциональных участка, укладываются в согласованную схему, если учесть соответствующие правила взаимодействия репрессора с оператором.
установленные с помощью экспериментов )и р!!го !табл. 4.2). Все эги данные позволяют заключить, что Ок, связанный с репрессором щ у!уо, может находиться в двух основных сосгояниях. В лизогенных клетках репрессор связывается прежде всего кооперативно с 0„! и 0„2; тем самым он стимулирует Р„и подавляет Р . При более высокой концспграции репрессор некооперативно связывается с Ок3 и выклк>- чае! Ркм (табл. 4.3).
(Одно замечание по поводу мутаций. Некоторые мутации. о которых шла речь в предыдущих разделах и будет упоми- Таблица 4.3 Два физиологически важных состояния оператора Оа фага Х, несуглего репрессор. Состояние, когда репрессор связан с (гк( и Ок2, цромотор Рк, включен (стимулирована а промотор Р„выключен (верхняя строка), характерно дия лизогенных клеток Охз Охз 0„! Рх Рхм х х Выключен х х х Выключен Включен Выключен наться в последующих, исходно возникли в операторах различных фагов Хпг, отобранных по способности к литическому росту в присутствии репрессора. Другие присутствовали в мутантах, отобранных с помощью специально сконструированных штаммов фатов и бактерий.) Многие проявления действия репрессора 1п п(уо можно воспроизвести зп у1(го.
Например, очищенная РНК-полимераза может использовать для транскрипции промотор Р„, и такая транскрипция блокируется репрессором или Сто. Ни один из этих белков не действует на полимеразу, уже связанную с Р„; факт, подтверждающий мысль о том, что оба белка конкурируют с полнмеразой за связывание. При концентрации, достаточной для заполнения Ок) и Ок2, репрессор стимулирует транскрипцию с Р, а при более высокой концентрации подавляет ее. В дальнейшем мы еще вернемся к вопросу об активности репрессора как белка, осуществляющего позитивную регуляцию, Сто вначале связывается с 0„3, а затем с О 1 н 0 2; таким образом, ои вначале выключает Р „, а затем Р„ (рис. 4.23) ((4 Некоторые общие сведеии.ч о бе,гке Сто [19, 20, 22, 31, 47, 44, 563 Одно из первых указаний на существование белка Сто было получено при проведении следующего генетического эксперимента (рис.
4.23). В лизогенных по фагу ). клетках, несущих температурочувствительную мутацию в гене с1, была удалена большая часть генов слева от е1 и справа от сто. О присутствии интактного гена е1 свидетеггьствовала иммунность клеток к фагу ). при низкой температуре (30'С). Если клетки выращивали при 42 С, т.е. в условиях, когда мутантный репрессор неактивен, у них наблюдались неожиданные свойства: клетки не только не были иммунными, как ожидалось, но они были «антииммунными». Это означает, что фаг ), дикого типа, который вообще не мог расти на этом ш гамме при 30'С, при 42'С давал только прозрачные бляшки.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
