Пташне - Переключение генов - 1988 (947309), страница 18
Текст из файла (страница 18)
1.16 и 1.22). При анализе О„обнаруживаются три сходные последовательности длиной по 17 пар оснований. Каждая из них обладает несовершенной вращательной симметрией второго порядка. Левый оператор О, также состоит из трех сходных участков (табл. 2.1). юа Химическое зондирование Г29, 30, 31, 32, б!3 Как показывают данные по связыванию с фильтрами и результаты футприпт инга, и репрессор, и Сго могут связываться с каждым из этих участков по отдельности. Оба белка защищают ог метилирования звенья О, лежащие с одной сзороны двойной спирали каждого из участков связывания (см. левую час~ь рис. 4.!б). Кроме того, репрессор в о|личие от Сго защищает один из двух звеньев О, лежащих с задней стороны двойной спирали примерно посередине каждого участка связывания.
Ниже мы покажем, чзо в этих взаимодействиях с задней стороны спирали участвуют гибкие «руки» Х-репрессора. Для идентификации тех фосфатных групп ДНК, которые контактируют со связанным белком, можно использовать химический агент этилнитрозомочевину. На рис. 4.16 отмечены фосфатные гругшы операторного учасгка 0„1, с которыми кон~актирует репрессоо. Они лежат по одну сторону двойной спирали.
Некоторые из этих групп контактируют с белком Сто, в том числе шесть «внутренних» фосфатов, по не четыре «внешних» 1считая от середины операторного участка к его краям). Как в случае репрессора, так и в случае Сго фосфаты, с которыми они контактируют, располагаются симметрично о гносительно центральной пары оснований операторного 1 час1 ха.
Метод, основанный на использовании этилнитрозомочевины для идентификации контактирующих с белками фосфатных групп, называется мегодом защиты от этилирования. Он позволяет определигь влияние присоединения этильнь1х групп к фосфатам, находящимся в различных положениях вдоль цепи ДНК, па последующее связывание белка. Даже если эти опьпы свидетельствуют о контактировании того или иного фосфата с белком, следует всегда учитывать, что на самом деле этилирование фосфата может препятствовать связыванию с ним белка. Мутантные операторы 1"23 Во многих точках последовательносги операторного участка длиной 17 пар оснований можно произвести замену пар оснований, приводящую к уменьшению эффективности связывания репрессора с данным участком.
Много мутангных операторов содержат ДНК фагов Хпг, которые способны расти в присутствии Х-репрессора. Первый из выделенных фагов ко1г содержал мутации в 0„1, 0 1 и 0«2. Если в дальнейшем использовать этот фаг для ото»ора мутантов, способных расти при более высоких концентрациях репрессора, чем в данном лизогенс, то можно выдели~ь новые мутанты, несущие допо.ч- юх т с А са А т т Т АА А и Т ААА катят АСТАП ггата тяатаа о„з 0„2 ! ! ОА1 С А ! Ранца! Ранна Рис 417 Мутшии в области Ок Этот набор мутаций следует сравнить с последовательностями, приведенными в табл 22 Мутации в положении 3 приводя~ в основном к уменыцению эффективности связывания Сто, но не репрессора, а мутации в положениях 8 и 9 в основном к снижению эффекгивности связывания репрессорл, но не Сто Мутации в остальных положениях оператора сопровождаются уменьшением связывания обоих белков Мутация Р нГ>, — ! активирует промотор Р„„в отсутствие репрессора.
а мутация Ряи !1б инактивирует Рк„ нительные изменения в тех же или других операторных участках. На рис. 4.17 указаны некоторые мутации, обнаруженные в О . Почти каждое звено оператора может быть местом вознйкновения мутации, приводящей к уменьшению эффективности связывания репрессора и(или) Сто. Наибольшее влияние на связывание репрессора оказывают мутации в звеньях 2, 4 и 6, и, как видно из табл.
2.2, именно эти положения наиболее консервативны. Основания в остальных положениях используются репрессором и Сто для того, чтобы различать операторные участки (см. рис. 2.11). Мутации, произошедшие в звеньях между операторными участками,— Р и ()р — 1 и Р„! 16-не влияют на связывание репрессора и Сго. Связывание со сверхспиралв>тй и линейной !(ОК [3>1 Репрессор связывается одинаково прочно с Ок! как в случае линейных, так и в случае сверхспиральных (со знаком минус) молекул. Судя ло этому результату, репрессор скорее всего не оказывает существенного влияния на структуру ДНК.
Этот вывод подтверждается результатами рентгеноструктурного исследования комплекса репрессора с оператором (см. ниже). Если бы репрессор раскручивал ДНК, например, на один виток, он гораздо прочнее связывался бы со сверхспиральпыми, чем с линейными молекулами. 10б Репрессор связывается с тремя операторными участками 0„, проявляя при этом альтернативную попарную кооперативность. Кооперативность обеспечивается взаимодействиями между С-концевыми доменами соседних димеров (рис. 1.16-1.19) Е10, 333. С помощью фугпринтинга с применением ДНКазы или ДМС можно оценить сродство репрессора к каждому операторному участку.
Эксперимент проводят при разных концентрациях репрессора, чтобы найти такую концентрацию, при которой половина этих участков занята и потому защищена от воздействия нуклеазы или какого-либо химического агента. Для изучения кооперативности таким методом используют ДНК с Оа, содержащим один, два или все три операторных участка. Как указано на рис. 4.18, сродство к репрессору Ок! и 0„2, входящих в состав оператора дикого типа, примерно одинаково, в то время как их «внутреннее» сродство в составе ДНК, несущей тот или другой участок по отдельности, различается более чем в 1() раз. Другими словами, репрессор связывается с операторными участками, входящими в состав оператора дикого типа, кооперативно. Сродство участка 0„3 увеличивается по сравнению с его «внутренним» сродством только при условии, что Он1 несет мутацию.
В этом случае репрессоры связываются с Ои2 и 0„3 кооперативно. Три участка оператора О„также связываются с репрессо- Кооперативное связывание Линий тнп неноопервтнвное связывание Кооперативное связывание Мутант неноопервтнвное свнзыввнне Рис 4!К Сролство участков оператора к интактному репреосору Числа >казывают относительное количество димера репрессора, необходимое для э~щиты соответствующего участка до уровня, составляющего половину от максимального в экспериментах по ДНКазному футпринтингу Таким образом, эти числа пропорциональны констан~ам лиссоциацин. Сродство соседствующих и искусственно разделенных сайгон различно (кооперативное и некооперативное связывание соответственно).
Если вместо интактного репрессора использовать )Ч-концевой домен, никакой разницы между кооперативным и некооперативным свизыванием не наблюдается. !07 ром согласно правилу попарной альтернативной кооперативности. Как и в случае 0„, наибольшим «внутренним» сродством обладает участок 0„1, а сродство участков Оь2 и 0,3 примерно одинаково. В составе оператора дикого типа 0„1 и О, 2 связывают рспрессор одинаково прочно, а если О, 1 несет мутацию.
то Оь2 и Ос3 связывают репрессор кооперативно. Сродство выделенных Я-концевых доменов к трем участкам О„соответствует сродству полного репрессора к каждому из этих участков по отдельности. Другими словами, удаление С-концевого домена никак пе сказывается на способное~и репрессора различать эти три участка, но полностью лишает его кооперативности, которая наблюдается при связывании димеров с соседними участками.
Энергия взаимодействия между димерами репрессора, связанными с ДНК, составляет примерно-" ккал!моль. Далее мы рассмотрим более подробно. какое влияние на экспрессию генов оказывает альтернативная попарная коопера ~явность. В лизогеняых клетках репрессор обычно связан с 0„1 и 0„2, Связанные молекулы репрессора выключают транскрипцию гена сгеэ осуществляющуюся слева направо, и стимулируют транскрипцию гена с1, идущую справа налево. При более высоких концентрациях репрессор связывается с 0„3 н выкгночает транскрипцию с( (рис. 1.1б и 1.19) (39, 41, 42, 43). Этол вывод основан о~части на результатах экспериментов, в которых изучали действие репрессора, связанного с каждым операторным участком по отдельности, на активность промоторов Р» и Ряи (п т!то, Результаты такого связывания приведены на рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
