Пташне - Переключение генов - 1988 (947309), страница 17
Текст из файла (страница 17)
или, что то же самое, когда димер рспрессора совершенно стабилен Такая кривая изображена на рисунке штриховой линией Проанализируем штриховую кривую на рис 412 более о к с Ь [к] подробно Эта кривая должна соответствовать следующей простой реакции КΠ— О + К, К =— (1) [ОК] где [К] — концентрация репрессора, [О1 — концентрация оператора, К вЂ” константа равновесия реакции (обратите внимание, что здесь, как и во всей книге, мы представляем константу равновесия как константу диеепг)наг)гги) Величина К равна концентрации репрессора в средней точке кривой, т е при ~О1 = [ОК1 Почему же кривая, описывающая взаимодействие ).-репрессора со своим оператором, имеет сигмоидную формул дело в том, что эта реакция идет не в одну стадию, как предполагает уравнение (1), а в две Первая из них — димеризация двух мономеров репрессора, а вторая — связывание димера с оператором Дммсузпзпг)ия К»=2К К =— [К]г г Связывание с пператорпл» [К ][О] КгО Кг+ О, Кг = [КгО] [2) 99 Рис 413 Анализ снгмоидной кривой связывания После преобразования уравнения (4) имеем [К]г)К = [К»О]1[0] Таким образом зависимость ')п [К] от 1и [К»0],,'[О] должна изображаться прямой с наклоном 2, как ззо н имеет место в лействительности Если бы репрессор связывался в виде тетрамера нак зон прямой был бы равен 4 Этот график представляет собой ту же сигмоилную кривую, что н на рнс 412 но построенную в других координатах Таким образом, суммарную реакцию можно представить в виде К О=2К+О, К=К,К 1К~з 1О) ГК Оэ ' 14) где )К1 — концентрация мономера рспрессора, ) Кз1 — концентрация димера.
В соответствии с этой моделью димеры ).-рспрсссора, способные прочно связываться с ДНК, легко диссоциируют на мономеры„которые связываются с ДНК очень слабо. Таким образом, при низкой концентрации репрессор не может связаться с ДНК. поскольку находится преимущественно в виде мономера. При увеличении концентрации мономеры ассоциируют, образуют димеры и связываются с оператором Из уравнения (4) следует, что если представить данные рис. 4.12 в виде зависимости !п1К,О~,') О1 от 1п [К), то должна получиться прямая с наклоном 2.
Именно такая прямая изображена на рис. 4.13. Ди,иер образуется до связывания с ДНК С1, 4, 537 Эксперименты, подобные изображенному на рис. 4.!4, мы называем экспериментами с изменением порядка введения компонентов. Концентрированный раствор репрессора разводят. например, в 100 раз в двух пробирках.
В одной пробирке содержится меченая операторная ДНК, в другойнет. Во вторую пробирку добавляю~ меченую ДНК, смеси фильтруют и определяют содержание комплекса репрессор— оператор. Результаты этих двух опытов, как ни странно. в корне различаются. ДНК, добавленная до репрессора, в основном связывается с фильтром, а добавленная после- в основном нет. Если мы теперь продолжим инкубацию пробирок, отбирая время от времени пробы, то обнаружим, что ДНК, добавленная после репрессора, также постепенно начинает связываться с фильтром; на это уходит около часа. Мы объясняем эти результаты следующим образом.
В исходном концентрированном растворе значительная часть репрессора находится в виде димера. Если репрессор добавляют в раствор, уже содержащий ДНК димеры быстро связываются с оператором, нс успев диссоциировагь на мономеры. Если же ДНК в пробирке отсутствует, то димеры диссоциируют на мономеры до тех пор, пока концентрация димеров не установится на гораздо более низком равновесном уровне, характерном лля разбавленных растворов. Если теперь добави~ь ДНК, репрессор будет медленно связываться с опе- !оо добавление днн Разведение репвесслва Определение связывания с Пзнлырлм через раллнчнме промежутки времени Разведение реплессала доаанленне дик определение связывания с фнльчпсм через Лаалнчнме леамемузлн времени Связывание днк, зь ц мэром и лимюнруюгцей стадией станет образование диюрного промежуточного продукта.
Оценки константы равновесия реакции димсризапии 121 цчз у величину К, = 2 1О"'н М. Зная эту величину и количесз«з репрессора, необходимое для связывания половины максим ~ьного количества ДИК в экспериментах. подобных при"цепному на рис. 4.12, можно вычислить К . Для связывания Он 1 в условиях, близких к внутриклеточным. т.
е, при 0,2 М 1чС1 и 37 С, К = 3 1О "М. В этих условиях время жизни комплекса рспрессора с оператором составляет величину порядка нескольких секунд. При более низких температуре и ,онцеупрации соли, когда связывание прочнее, время жизни комплекса достигает минут и даже часов. !Оу Время Рис 4 14 Экспсричзецт с изменением порядка добавления кочзпоэнеи~ов Мо- ~ омсры рспрсссора связываются с ДНК ысддснио. поскольку они вначале эжны образовась димсры, а этот процесс при низкой концентрации рспрссицеу медленно Дичсры связываются с ДНК бысэро Если ДНК » з уствуст в смеси до добавления рспрсссорз.
димеры успевают связаться ешс до циссоцизции С' ДНК контактирует зч-конзуелой домен г23, 45, 581 Весьма полезным методом изучения ДНК-белковых взаимодействий является так называемый футпринтинг грис. 4.15). Некий белок, связанный с определенным участком ДНК, защищает его от расщепления, например, ДНКазой, которая в обычных условиях случайным образом вносит в ДНК одноцепочечные разрывы. На практике обычно вначале получают фрагменты ДНК, меченные з'Р по одному из концов одной цепи. Затем добавляют такое количество ДНКазы, чтобы внести в каждую молекулу в среднем не более одного разрыва, ДНК денатурируют и проводят гель-электрофорез.
В геле образуется «лесенка», причем каждая следующая ступенька, считая снизу вверх, отвечает цепочке ДНК, отщепленной на один нуклеотид дальше от меченого конца, чем предыдущая. Если теперь провести такой же эксперимент в присутствии репрессора, то в том месте «лесенки», которое соответствует участку ДНК, связанному с рспрессором, поя- днказа днназз зз зз зар денатурация Гель-злентлонролез Рлдиеаагеглалшл нерасшелленньза фрагмент Нерасшелленнын фрагмент Пропуск м Рис. 4.15. Д1!Казный футпринтинг. Продукты реакпии выявляют с помогпью радноавтографии, поэтому немеченая ДНК нс обнаруживается. После гельэлеьтрофореза образуется нлесснка» из полос. каждая из которых соответствует цепочке ДНК, на один нуклеознл более ллиной. чем в слелуютей нступснькен, если и:пн сверху вниз.
102 вится пробел (отпечаток, или футпринт) Другими словами, там, где связан рспрессор, ДНКаза не может внести разрыв в ДНК, и поэтому фрагменты, которые образуются в резуль1ате расщепления чистой ДНК в этом участке, отсутствуют Сходный метод изучения ДНК-белковых взаимодействий основан на использовании метилирующего агента диметилсульфата (ДМС) В двухцепочечной ДНК ДМС переносит метильную группу главным образом на атомы двух оснований, Сз и А Сз метилируется по атому, выступающему в большой желобок (азот Х7 согласно общепринятой нумерации атомов), а А — по атому, выступающему в малый желобок (азот ХЗ) — 14 12 1О— 9 большой шелобои Малый шелобон 6 ~ — -4 Большой шелобон Певейняя стояона ! Задняя сторона 17 !О илстлт тт СТ6АТААА АТ66ТТ6 ТАССААС Оя! Рис 41б Участки оператора, коитактирующие с рспрессором Внизу приведена иукчеотидиая последовательность оператора и отмечены звенья Сь которые репрессор защищает от метилироваиия диметилсульфатом Эти ыщищеииые звенья показаны иа спирали ДНК Четыре из звеньев С», участвуиэщих во взаимодействии, видны в большом желобке иа передней сгороие спирали Н в паложеиии ! ! ие просматривается, ио, подобио другим гз иа этой стороне спирали, ои должен контактировать с а-спиралью, лежащей в болыпом желобке с этой стороны Еще два звена, контактирующие с репрессором, лежат иа задней стороне спирали На рисунке показаны также фосфатиые группы, взаимодействующие с репрессором Ромбиком отмечена ось симметрии второго порядка 103 В месте метилирования чувствительность ДНК к химическому расщеплению резко увеличивается.
В результате расщепления молекул по метилированным участкам после электрофореза образуется «лесенка», каждая ступенька которой соответствует расщеплению по метилированным звеньям А или Сь Репрессор. связавшись с ДНК, может загцитить соответствующие основания от метилирования; это позволяе~ обнаружить пары оснований. которые расположены ближе всего к связанному белку.
Иногда в присутствии белка по непонятным причинам увеличивается скорость метилирования определенных участков; такое же явление наблюдается и при ДНКазном расщеплении. В экспериментах по ДНКазному футпринтингу репрессор защищает участок оператора длиной 17 пар оснований плюс еще по нескольку пар оснований с обеих сторон. Как видно из рис. 4,! б, он защищает от метилирования под действием ДМС и звенья 1э в пределах оператора, но не вне его.
На метилирование А репрессор не влияет, и это согласуется с представлением о гом, что он располагаегся в большом, а не в малом желобке оператора. Итак, отметим ~лавное: изолированные Х-концевые домены ведуг себя подобно иптактным димерам, за исключением з ого.
что для защиты от расщепления необходима более высокая их концентрация. Таким образом, единственный вклад С-концевого домена в связывание димера с операторным участком состоит в том, что он увеличиваег силу связывания, удерживая вместе два 1х1-концевых домена. Имеюгся данные, что и в клетке Х-концевые домены в отсутствие С-концевых связываются с оператором: штамм Е. со11, в котором образуется большое количество дефектного репрессора, включающего только остатки 1 — 92, устойчив к суперинфекции фагом Х, Правый оператор состоит из трех участков связывания репрессора длиной 17 пар оснований каждый. Репрессор и белок Сго связываются с одной и той же стороны двойной спирали в каждом участке связывания (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
