Пташне - Переключение генов - 1988 (947309), страница 20
Текст из файла (страница 20)
Эффект оказался чувствителен к типу иммунности: например, фаг 2.1лтптези образовывал на этом штамме нормальные мутные бляшки при обеих температурах. Из всего этого можно было сделать только один вывод: оставшийся в бактерии участок фагового генома кодирует какой-то фактор, специфичный по отношению к области иммунности фага )., который направляет развитие заражающих клетки фагов Х по литическому пути.
В зависимости от характера эксперимента эгот фактор обозначали по-разному: А1 (о1 англ. апй-пппшпну — антииммунность); ТоГ (от англ. шгп оГà — выключение) или Сто. Теперь мы знаем, что единственный ген сто, транскрибируемый с промогора Р„, обеспечивает образование достаточного количества белка Сто, чтобы клетка стала антииммунной. Антииммунность является, очевидно, следствием частичного подавления промоторов Р„и Ра под действием Сто и связанной с этим пониженной экспрессии генов с1! и с111. Обсудим состояние правых оператора и промотора в таких атпииммунных клетках. При связывании Сго выключает Р„, но по мере роста и деления клеток концентрация Сто уменьшаегся и Рк снова включаешься. Так устанавливается состояние динамического равновесия, когда скорость синтеза Сто в гочносги равна скорости его разведения и, по всей вероятности, поддерживается его постоянная концентрация.
В этом случае Сго снижает, но не подавляет полностью свой собственный синтез. зо'с Иммунное состояние ег с Антииммуннае состояние 115 Рис 4.23 Иммуштость и антннммунность Клетки содержат мутантный репрессор й, который хорошо работает при 30 С, но денатурирует при 42 С. Ири повьнпснной температуре включается синтез белка Сто Гна рисунке он обозначен буквой С), но клетки не лизируются, так как все остальные фаговые гены улалены. Белок Сто направляет проникающие в клетку фаги по лнтнческому пути развития Если понизить температуру до 30"С, клетки снова переходят в иммунное состояние.
Исходно белок Сго был выделен из клеток, где шла литическая инфекция, в опытах по связыванию с фильтрами. Это был один из белков, ко~орые специфически связывались с ДИК фага ).. Соответствующий ген был клоннрован и соединен с различными призводными 1ас-промотора. В клетках, содержащих такие плазмидные конструкции, Сго может синтезироваться в различных количествах. Если содержание белка достаточно высоко (до нескольких процентов суммарного количества), его легко выделить, и многие биохимические подходы, использованные в случае репрессора, были применены н при изучении Сто.
Белок Сго ьч п)ио г42) Клетки, несущие плазмиды, которые детерминировали синтез Сто под контролем 1ас-репрессора, использовались для изучения влияния Сто в различных концентрациях на промоторы Ра„и Рк )п ичо. РезУльтаты одного такого экспеРименза, аналогичного представленным на рис. 4.20, показали, что под дейсгвием Сто Р„выключается (в данном случае использовали Р и ~lр — )), а при более высокой концентрации выключается также Рк !рис. 4.24). Используя мутантные операторы аналогично тому, как это было в случае с репрессором, удалось установи~ь результат связывания Сто с каждым из операторных учао~кон О„по отдельное~и (табл.
4.4). Итак, в качестве белка с негативным регуляторным эффектом Сто идентичен репрессору: связываясь с Ок! и ОК2, он о с с с с с с с )С:)ьз С2ПС:) ИС2СЭ ИИИ 3 7 ! з 7 1 с с 3 т ! ИС2П Концентрация сто Рис. 4 24 Регуляторное действие белка Сто !и ыто. Ген гго можно ввести вместо гена г! в бактериальные клетки (см рис, 4 19) и. добавив ИПТГ. индупировать синтез Сто Используя конструкции Р„-)аг У и Ря„1)р -1-)аг л, мои!но показать, ято Сто оказывает негативное действие на оба промотора Фага Х, 116 Таблица 4.4.
Влияние связывания лимера Сто с един- ственным участком О . В отсутствие репрессора или Сто !верхняя строка) Р„„и Р„включены, поскольку был использован мутайт Рх„Г)р — ! О! Оз О! ОР- ! Включен х Выключен х Выключен х Включен Включен Включен Включен Выклнзчсн Таблица 44К Физиологически важные сост ояния оператора О„фага Х. связанно!о с Сто Р „ггл — ! Очз Охт О„! Р„ Включен Выключен Выключен Выключен Выключен Включен Включен Выключен Выключен Выключен выключает Рр, а связываясь с Ор 3, выключает Рр .
Эти данные вместе с данными о порядке связывания с разными участками Ор (рис. 1.23) позволяют судить об основных физиологических состояниях оператора, связанного с Сто. Соответствующие сведения приведены в табл. 4.5. Белок Сго т о!Ухо 132, 62, 633 )!7 Сго образует стабильный димер, и нет никаких данных, что он состоит более чем из одного домена; об этом же свидетельствуют результаты рентгеноструктурного анализа (рис.
2.9). Эксперименты по футпринтингу показывают, что Сго связывается некооперативно с тремя участками О„и с тремя участками О„. По сродству к Сго участки Ор располагаются в порядке, указанном на рис. 1.23„г. е. 0„3 > 0„2 = Ор 1, а участки Π— в порядке О, 1 ~ О, 2 = О, 3. В !1,2 М КС! при 37"С Сто связывается с Ор 3 так же прочно, как димер репрессора с Ор 1. Сродство Сго к Ор 2 и 0„1 примерно на порядок ниже, чем к 0„3. Сто блокирует транскрипцию с промотора Рр, но только при добавлении его в смесь, содержащую ДНК, до полимеразы. Для проявления такого эффекта Сго должен связаться с участками Ор! и Ор2, а удаление участка Ор3 никак не сказывается на подавлеьии Р„. При введении до полимеразы Сто блокирует транскрипцию с Рр„независимо от того, содержит ли матрица нормальные учао~хи О» 1 и Ок 2, несущие репрессор, или используется мутантная матрица Р Ор — 1.
Этот вид репрессии не проявляется, если участок 0„3 мутантен и Сго не может с ним связаться. Белок КесА расщепляет репрессор н тем самым запускав~ индукцию (ряс. 1.21) ~16, 36, 57, 59~ После индукции в лизогепных клетках дикого типа расщепленный репрессор можно обнаружить в клеточных экстрактах. Необходимым условием расщепления являются УФ-облучение и наличие продукта гена гесА.
Если клетка-хозяин повреждена, так что ген тес А инактивирован, репрессор не расщепляется и индукция фага ст.ановится невозможной. В случае клегок, несущих некоторые мутантные формы гена гегА, УФ-облучение в определенных условиях может не понадобиться: индукция лизогенов в этом случае происходит просто при повышении температуры, без всякого облучения. Расщепление репрессора можно провести 1п т1гго с помощью очищенного белка КесА.
Х-Репрессор расщепляется между остатками А1а и О1у в положениях 111 и 112; этот процесс стимулируется короткими одпоцепочечными фрагментами ДНК и АТР. Некоторые другие репрессоры, в том числе репрессор фага 434 и белок 1.ех А, также можно рас~цепить 1п тйго, причем и в этих случаях расщепление происходит между остатками А1а и О!у, расположенными в пептидс, соединяющем два домена. При рН !0 эти репрессоры могут расщепляться по указанной связи и слон~анно; при рН 7,0 реакция идет медленно, но значительно ускоряется в присутствии очищенного белка Кес А.
Степень расщепления репрсссора в лизогенпых клетках определяют в опытах по связыванию с фильтрами. Расщепления 30')1 молекул недостаточно, чтобы вызвать эффективную индукцию, для этого необходимо, чтобы расщепилось 80'А молекул репрессора. Связывание Сто с Ок 3 запускает механизм переключения (рнс. 1.24) ~5) Связывание С го с 0„3 играет ключевую роль в индукции. Об этом свидетельствуют следующие два эксперимента.
В первом из них использовали фаг Х, мутантный по О, 3, с которым не може~ связываться Сто. Такой фаг дает обычные по виду мутные бляшки, но содержащие его лизо~енные клетки очень слабо индуцируются при УФ-облучении. Это означает, что для эффективной индукции необходимо, чтобы Сго связывался с Ок3. В ходе второго эксперимента использовали плазмнду, детерминирующую синтез Сто под контролем 1ас-репрессора.
Эту плазмиду вводили в одном случае в лизогенпые клетки ликого типа, а в дру>ом — в лизогенные клетки, мутантные по О„ 3. Когда синтез Сто индуцировали добавлением ИПТГ, происходила индукция только лизогена дикого типа, но не мутантного лизогена. Таким образом, связывание Сто с Ок3 запускает индукцию. Репрессор и Сто связываются с оператором так, как это показано на рис. 2.6, 2.8 и 2.10 Эти рисунки иллюстрируюг не только идентичность конфигурации представленных комплексов, ио и то, что именно аминокислоты, расположенные в узнающих спиралях (а также в «рукахл ).-репрессора), определяют специфичность связывания с дапнои последовательностью. Эти два близких аспекта исследуют с помощью рентгеноструктурного анализа и биохимических экспериментов.
Рентгеноструктурный анализ г13, 14, 17, 40, 493 Структура Х-концевых доменов репрессора и Сго в кристаллах установлена с высоким разрешением. Как видно из рисунков гл. 2, имеет место структурное соответствие между ними и В-формой ДНК. Согласно пространственной модели еще одного специфического ДНК-связывающего белка Е. са11, белка — активатора катаболизма (БАК), контак~ между ним и ДНК тоже осуществляется посредством биспирального элемента, описанного в гл. 2. Во всех случаях одна из а-спиралей (узнающая) укладывается в большой желобок, а другая распола> ается поперек него. Адекватность этих моделей ДНК-белковых комплексов подтверждаю~ результаты рентгенострукгурного анализа комплекса репрессора с оператором в крис- галлах.
В состав исследованного комплекса входил репрессор фага 434, близкородственного фагу ); о нем уже шла речь в з>ой книге. В составе комплекса репрессора с оператором фага 434 два М-кон>1евых домена связываются с одним операторным участком, который в данном случае имеет длину 14 пар оснований, Узнающая спираль каждого из доменов встраивается в большой желобок, а пред>пествующий участок а-спирали располагается поперек него.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
