Пташне - Переключение генов - 1988 (947309), страница 16
Текст из файла (страница 16)
ФРанции Рис О 5 Выдезение й репрессора В денствнтсльности й рспрессор бы| вслед ю выдетен с помощью избирательного мечення репрессора присутствующего н н тетке в ничтожном количестве Скорость синтеза репрессора по сравнению тругими к юточными бетками была увеличена с помощью УФ об ~учения к та зто описано в тексте Мутант с! был использован для того чтобы по;оверднть что меченыи белок действительно является продуктом ~еда г! разрушили их и проанализировали содержимое, то обнарулгили лишь один белок, меченный ЗН, но не 'аС Репрессор составлял незначительную часть конечной смеси белков, но зд его судьбой можно было следить благодаря его специфической радиоактивности Что же делал этот белок — продукт г ена гР С помощью единственного эксперимента было показано, что он специфически связывался с коротким участком двухцепочечной ДНК фага Х, содержащей соответствующие операторы Радиоактивно меченный продукт гена с1 смешали с ДНК фага й.
в одной пробирке и с ДНК Хгизглазо в другой и смеси по отдельности цетрифугировали в сахарозном градиенте (рис 46) В этих условиях молекулы„близкие по размеру к ДНК фага Х, оседают гораздо быстрее, чем свободный репрессор, и эти два компонента легко разделить Оказалось, что 9! ЛНК фага Л ЙНК Фага Лгтт Р аитивно меченнь>й Л-реиреесер Наппавпение сеаиментании О- анс Мениск Рис 4 б Спепнфическое связывание Л-репрессора с ДНК фага Л Этот эксперимент показывает, что Л-репрессор связывается с ДНК фага Эч но не с ДНК Лапгнчзи Аналогичным образом репрессор фага 434 связывается с ДНК фага Лгмт ч, но не с ДНК фага Л Поскольку эти две ДНК различаются только областью иммунности, репрессоры снязываются с участками, расположенными именно в этих областях Как показали дополнительные эксперименты.
ДНК. вылелениая из фага Лтг, связывает Л-репрессор гораздо слабее, чем ДНК фага Л дикого типа Это подтверждает, чзо репрессор связывается с операторами фага Л, выявленными генетическими методами меченый белок движется вместе с быстро седиментирующей ДНК фага Х, но не с ДНК 2ч иипзеза, котозпая седиментирует так же быстро. Напомним, что ДНК Х лпзпза " отличается от ДНК фага Х только короткой областью хромосомы, несущей гены с1, сто и операторы (рис. 4.2). Результат этого эксперимента с убедительностью показывал, что ген с1 кодирует репрессор. 92 который специфически связываешься непосредственно с опера- ~ором Кроме того, если ДНК подвергали денатурации, т.е.
разделяли цепи двойной спирали нагреванием, совместной седиментации белка и ДНК не происходило. Следовательно, оператор должен представлять собой двухцепочечную ДНК. Получение большого количества реирессора ~12, 15, 5б~ Чтобы изучать структуру репрессора, необходимо было прежде всего сконструировать штаммы Е. со!г', образующие его в большом количестве, чтобы репрессор можно было легко выделять. Это стало возможным с появлением рекомбинаптных ДНК. Ген с1 был клонирован, т.
е. вырезан из хромосомы фага г с помощью разрезающих ДНК ферментов (ферментов рестрикции), и встроен в плазмиду. Плазмида-это кольцевая молекула ДНК, гораздо меньшая, чем хромосома Е. соЬ, и представленная в каждой клетке в данном случае в количестве '5-50 копий. Плазмида реплицируется независимо от хозяйской ДНК, ес можно выделить из клеток, модифицировать и ввести в другие клетки. Ферменты рестрннннн в дКК Фзгнд А В Л Фрагмент ДНК ьт: ..звв йнезмидз Ген утлейчннести и антибнатину Пнззмида, сбесиечиеаюшан знснрессию Рис 4 7 !1лазмида, обеспечивающая синтез большого количества репрессора Она несет ген с! фага А, присоединенный к области промотора и оператора йк-оперона (Ор) Прн смешивании клеток Е сои с плазмндной ДНК послелннв со сравнительно низкой частотой проникает в клетки В плазмидс присутствует ген устойчивости к антибиотику, поэтому в присутствии антибиотика растут только клетки, содержащие члазмиду, и нх легко отобрать Однако, если просто увеличить число копий гена с(, количество синтезированного репрессора увеличится лишь незначительно.
Напомним (гл. 1), что при умеренно высоких концентрациях репрессор выключает свой собственный ген, связываясь с Ок3. Таким образом, чтобы получить очень много репрессора, нам придется заменить его обычный промотор Р„„каким-либо иным промотором, который пе находится под контролем ).-репрессора. Как видно из рис. 4.7, мы выбрали промотор, с которого обычно считывается ген (асЯ. Был выделен фрагмент ДНК, содержащий этот промотор вместе с сигнальными последовательностями, необходимыми для эффективной трансляции мРНК; затем этот фрагмент был присоединен к самому началу гена г(. Такая конструкция, введенная в клетки в составе рекомбинантной плазмиды, обеспечивала синтез большого количества репрсссора. В настоящее время получены штаммы с модифицированным промотором (ас (он называется шс). В этих клетках репрессор составляет до 20'.4 всего синтезируемого клеточного белка и его легко выделить в чистом виде. Основные положения гл.
1 и 2 Репрессор состоит из двух глобуляриых доменов, соединенных мостиком примерно из 40 аминокислот (рис. 1.6) !50, 643 При обработке очищенного репрессора какой-либо протеазой, например папаином, образуются два сравнительно устойчивых фрагмента (рис. 4.8). Анализ их аминокислотной последовательности показывает, что один из этих фрагментов происходит из Х-концевой части репрессора (остатки 1 — 92), а другой -из С-концевой (остатки 132-236).
Оба фрагмента ведут себя как типичные глобулярпые белки, и их можно легко разделить. Пло.гно упакованные участки белков обычно более устойчивы к протеазам, чем участки, находящиеся в развернутой конформации, поэтому эксперименты по расщеплению позволяют показать, что М- и С-концевые участки образуют два отдельных домена. При повышении температуры белки или их домены переходят в неупорядоченное состояние (денатурируют). причем каждый домен обладае~ своей собственной характерной температурой денатурации.
Если измерять температуру дснатурации для каждого нз доменов по отдельности, то окажется, что Х-концевой фрагмент репрессора денатурирует при температуре примерно на 20'С ниже, чем С-концевой !рис. 4.9). При нагревании интактного репрессора наблюдаются два отдельных пика денатурации, которые в точности соответ- 94 фФ Интвитный моиомер С-концевой домен и-иоицеваи домен Рис. 4лй Протеолитическое расщепление и-репрессора. Один из способов выявления ломснов в составе какого-либо белка состоит в том, чтобы выясни гь, не содержи у ли он учасу ки, сравнительно устойчивые к протсолизу Папани легко расщепляе~ сегмент Х-репрессора с 93 по 13! остаток, но М- и С-концевая области нс расщепляются.
Зги домены можно разделить с помощью гель-злектрофореза, поскольку они имеют разный размер и об- разуют в геле две полосы. о х я е а с Ю Температура Рис. 4.9 Дснатурация и-репрессора и его выцеленных доменов. Разворачивание молекулы и-репрессора происходит в два згапа при двух разных температурах, которые соответствуют температуралу леиатурации изолированных ломснов. (Денатурацию исследуют с помощью прибора, который называется сканирующим калоримезром. При денатурации происходит поглощение тепла, изменение количества которого по мере увеличения тем- пературы и измеряез сканирующий калориметр.) ствуют пикам денатурации изолированных фрагментов. Следовательно, даже в составе интактной молекулы домены денатурируют более нли менее независимо Исследования с помощью ядерного магнитного резонанса (ЯМР) также указывают, что связь Х- и С-концевого доменов в составе интактного репрессора отличается значительной гибкостью.
Репрессор димеризуется главным образом благодаря взаимодействию С-концевых доменов (рис. 1.7) 11, 4, 501 Анализ с помощью гель-фильтрации и седиментации показывает, что при низкой концентрации (10 "М) репрессор находится преимущественно в виде мономера, при более высокой (10 т М) — преимущественно в виде димера, а при очень высокой концентрации (10 з М) — в основном в виде тетрамера Выделенные С-концевые домены (остатки 132 — 236) образуют димеры и тетрамеры почти столь же эффективно, как и интактные мономеры, а )х(-концевые домены к этому не способны (рис. 4.!О).
Некоторые взаимодействия между г)- концевыми доменами выявляются с помощью рентгеноструктурного анализа Учитывая, что константа равновесия для димеризации интактиого репрессора равна К = 2 10 Я М (см. ниже), а концентрация репрессора в лизогенных клетках составляет примерно 4 1О " М, можно заключить, что около 95"е репрессора в этих клетках находится в виде димера и 5еУ вЂ” в виде мономера Концентрация репрессора, при которой половина молекул находится в виде тетрамера, по крайней мере в 100 раз выше, чем его концентрация в лизогенных клетках, поэтому ш ч1чо образуется очень мало тетрамеров репрессора.
Рис 4 Ю Димеризация расщепление! о Х-репрессора Расщепление папаином практически не сказывается на способности С-концевого домена Х-репрессора к лимеризации Димер репрессора связывается своими 1ь1-концевыми доменами с операторным участком длиной 17 пар оснований 1рггс 1 Р) Рис. 1.9 предполагает, что установлены три важных факта. ФВо-гтервых, один операторный участок связывает один димер репрессора. ° Во-вторых, димер образуется до связывания мопомеров с ДНК, т.
е. мономеры не связываются с ДНК по отдельности. ° В-третьих, с ДНК контактирует только М-концевой домен. Рассмотрим эти три положения по отдельности. Один оперигиорный учасьноь свлзьииет один дихтер релрессори Гз', 4, 55~ Важный подход к анализу связывания ДНК с белками основан па изучении связывания их с нитроцеллюлозными фильграми (рис.
4.11). Этот метод позволяет аккуратно определять концентрации компонентов в состоянии равновесия и кинетические параметры реакций. Метод основан на том, чзо двухцепочечная ДНК свободно проходиг через фильтр, тогда как репрессор, подобно боль- Нитроцеллюлозный фильтр в Вакуум Рис. 4.11.
Анализ связывания ДНК с белками мезолом фильтрации. ДНК иессз радиоактивную метку, а белок нет. Чем вьлне концентрация белка, тем больше ДНК задерживается на фильтре. 97 т !зз! 1раъ Снязаннан ДНН он концентрация репрессора Рис 4 1З Связывание репрессора с ДНК Штриховая кривая -пример так называемой кривой Михаэлиса Ментсн Она описывает реакцию связывания когда димер репрсссора стабилен при любых концентрациях и с операторным участком Од! связывается единственный лимер В лействительности свя зывание с ДЙК фага л описывается сигмоидной кривой (Строго говоря под концентрацией рспрессора должна подразумеваться концснтрацияи свобод ноно репрессора гк1 з е общая конпентрация репрсссора Гйт1 минус кон центрация репрсссора связанного с оператором [Ок1 Однако н данном случае репрессор находится в большом избытке по отношению к оператору поэтом> ПЧ = Гк,11 шинству других белков, остаемся на нем ДНК, связанная с белком, задерживается на фильтре, и если она помечена радиоактивным изотопом (например, ззр), легко измерить, какая часть ДНК и, следовательно, репрессора задерживается на фильтре при различных условиях Например, при высокой концентрации ДНК, ко~да все молекулы репрессора связаны, зная число молекул ДНК, задержавшихся на филю ре, можно определить число активных, т е способньгх связывать ДНК, молекул репрессора в данном препарате На рис 4!2 приведена зависимость доли связанных с репрессором молекул ДНК, несущих единственный операторный участок 0„1, от концентрации репрессора Кривая построена по данным связывания ДНК с фильтрами Для того чтобы получить каждую точку этой кривой, смесь репрессора при данной концентрации и ДНК инкубировали до досгиженим равновесия, а затем проводили фильтрацию Удивительная особенность этой кривой заключается в том, что она имеет З-образную, или сигмондную, форму и отличается ат кривой, ожидаемой, например, для случая, когда для связывания ДНК с фильтром достаточно, чтобы с оператором был связан один мономер репрессора.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
