Пташне - Переключение генов - 1988 (947309), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Ссылки на них читатель найдет в обзорах, указанных в списке литературы, Гипотеза о существовании репрессора Мысль о том, что фаг Л кодирует репрессор — молекулу, которая выключает все остальные фаговые гены, была сформулирована французскими учеными Ф. Жакобом и Ж. Моно и их коллегами в конце 50-х - начале 60-х годов. Рассуждения этих исследователей основывались прежде всего на генетических данных, начиная с некоторых простых наблюдений, касающихся роста фага. В данном разделе описаны три группы таких наблюдений и дано их объяснение„основанное на гипотезе о существовании репрессора. Прозрачные н вирулентные мутанты Наблюдения Для наблюдения за ростом фага Л поступают следуюшнм образом. Смешивают несколько фаговых частиц примерно с миллионом бактериальных клеток и выливают смесь в чашку с агаром. В процессе роста бактерии образуют газон по всей поверхности агара.
Но одновременно с бактериями растут и фаги, и каждая фаговая частица приводит к формированию бляшки, т.е. дырки, в бактериальном газоне (рис. 4.1). Бляшки, образованные фатами Л дикого типа, мутные ва (непрозрачные), потому что, хотя по мере увеличения бляшки многие зараженные бак~ерин лизируются„некоторые продолжают расти на поверхности самой бляшки. Если эти бактерии, выросшие в середине бляшки, переколоть и вырастить, то обнаружится, что они устойчивы к заражению другими фатами Х. Такие устойчивые клетки лизогенны: при облучении УФ-светом они лизируются и дают новое фаговое потомство. Однако иногда можно наблюдать появление прозрачных (не мутных) бляшек.
Каждая прозрачная бляшка образуется под действием мутантпого фага )х, у которого нарушена способность лизогенизировать клетки, но в остальном он растет нормально, Прозрачная бляшка представляет собой зону сплошного лизиса и не содержит лизогенных бактерий. В большинстве таких прозрачных мутантов поврежден один из трех генов: с1, сП или с!11.
Можно выделить редкие клетки, лизогенизированные мутантными по генам сП или с1!1 фагами. Изолированные лизогены такого типа стабильны, устойчивы к фагу и индуцируются при УФ-облучении. Однако получить лиэогенные клетки, содержащие фаг, мутантный по с1, невозможно. Мутанты фага ).по с1 не могут лизогенизировать клетки, при этом, подобно другим прозрачным мутантам и фагам дикого типа, опи не способны лизировать клетки, лизогенные по фагу )х. Еще один мутант фага Х, который обозначается ). пг 1от англ.
р!гп!епг - вирулентный), растет как на лизогенных, так и на нелизогенных бактериях. Такие мутанты, образующие прозрачные бляшки равно на лизогенных и нелизогенных клетках, возникают в популяции гораздо реже, чем обычные мутанты с прозрачными бляшками. Этот факт позволяет Бантериальный газон Агар Лизогены ~ф ~! х~ Область ~ ливиса Мутные Прозрачные бпяшпи бляшни Рис 4.Б Бляшки, ко~орые образует растущий фаг х.
Фаг смешивают с бактериями и смесь выливают на чашку с агаром. Фаг вызывает лизис зараженной клетки, высвободившееся фаговое потомство заражает близлежащие клетки, и этот процесс повторяется многократно. Лизогенныс и. следовательно, иммунные клетки растут в центре бляшек, образованных фатом х ликого типа, поэтому бляшки мутные. предположить, что мутант Л луг содержит более одной му- тации. Обьяенение В лизогенных клетках продукт гена е! — репрессор- выключает все фаговые гены, кроме е1, в том числе гены, необходимые для литического роста фага. Гены еП и еП! участвуют в установлении лизогенного состояния на ранней стадии заражения, но не нужны для поддержания состояния лизогении.
Как мы уже знаем, белок СП при участии белка СГП включает транскрипцию гена еЕ Фаг Х иг содержит мутации в местах связывания репрессора, которые теперь называются операторами; репрессор не может связаться с такими мутантными операторами, и потому л пг вызывает литическую инфекцию даже в присутствии репрессора. Чтобы фаг Х стал вирулентным, в нем, как нам теперь известно, должны возникнуть мутации в двух операторах, О„ и Ок. Иммунносзь и гетеронммунность Наблюдения Фаг Х вЂ” всего лишь один из представителей обширной группы фагов, которые инфицируют Е. еой и могут лнзогенизировать ее. Типичный представитель л-подобных фатов — фаг 434. При росте на Е.
еой он, как и фаг Х, образует мутные бляшки; для него известны вирулентные мутанты и мутанты с прозрачными бляшками. Удивительное свойство клеток, лизогенных по фагу 434, состоит в том, что они устойчивы к этому фагу, но чувствительны к фагу Х; рост фага Х на клетках, лизогенных по фату 434, практически неотличим от роста на нелизогенных клетках. Точно так же клетки, лизогенные по фагу Л, чувствительны к фату 434. Такие взаимоотношения между фагами Х и 434 называются гетероиммунностью.
о, о„ Область лммуяностя ьз4 Рис. 4Д. Область иммунности. Размер области иммунности фагов Л и 434 составляет всего несколько пронентов суммарной ллины фаговых хромосом. Таблица 4.!. Бляшки, которые образуют различные фаги при заражении трех штаммов бактерий. Устювия выращивания указаны на рис. 4.! х зс! Хзо 434 З. зшш" м Н гон К М П П М М К (Ц П М М К [), (шшчза) М П П чпе означает, что бляшки прозрачные, емя .
музиые, прочерк-бляшки не образую~се К (Ц вЂ” штамм К са!з К, .чизогенный по фа~у Х Результаты эксперимента с клетками к(434) будут закнми не, кдк и с к (л (шшчз Е Эксперименты по генетической рекомбинации показали, что особенности иммунитета каждого фага определяются неболыпим участком фаговсй хромосомы, который называется областью иммунности. Как видно из рис. 4.2, в эту область входят гены с! и с«о н участки, на которые действуют продукты этих генов. Гибридная хромосома, которая содержит все гены фага у,, кроме области иммунности, замененной на соответствующую область фага 434, обладает иммунностью, характерной для фага 434. Поэтому такие фаги, обозначаемые Х (нзн)"зе или 434 )зу, дают лнзогсны, устойчивые к фагам 434, но не к фагам )., в то время как сами гибриды могут расти на лизогенах по фату Х, но не по фару 434.
В табл. 4.1 суммированы данные о росге различных фатов на разных лизогенах. Объяснение Фаг 434 кодирует репрессор, специфичность которого отличается от специфичности репрессора фага Х; он связывается с операторами фага 434, но не у., репрессор же фага Х, напротив, не может узнавать операторы фага 434. Область иммунности, выявленная в экспериментах с гибридными фагами ).-434, включает ! ен с1 и, как мы теперь знаем, ! ен с«о, а также левые и правые операторы н промоторы.
Тот факт, что гены с11 и гЛ1 не входят в область иммунностн, означает, что белки СП и СГИ фага т. способны включать ген с1 фага 434, н в свою очередь белки СИ и СИ1 фага 434 могут включать ген с1 Х. Асимметрия бактериальной конъюгации Ниблюдения Лизогены по фагу Х., подобно лизогенам по другим фатам, в экспериментах по конъюгацни бактерий ведут себя асимметричным образом. При конъюгацни бактерий мужские клетки Е. со(!' присоединяются к женским клеткам и вводят в них свою сг (лизоген3 оя(лизаген1 от (лизеген3 (нелизлгенная илетнн3 Р ис 4 3 Зиготная индукция Г!ри конъюгации бактерии гены донорнои клетки вхолят в реципиентную клетку в определенном порядке Различные донорные штаммы начинают перенос кольцевой хромосомы игла с разных ее участков Белки, в том числе репрессор ц не переносятся в реципиентную клетку прн конъюгации ДНК.
Если женская клетка или обе родительские клетки лизогенны, конъюгация протекает нормально и в результате образуется зигота. Зигота представляет собой материнскую клетку, несущую некоторые дополнителъные гены отцовской клетки. Однако если мужская клетка лизогенна, а женская — нет или если женская клетка лизогенна по фагу с другим типом иммунности, многие женские клетки лизируются, давая фаговое потомство.
На рис. 4.3 схематически изображен этот процесс, который называется зиготной индукцией Объяснение Как следует из рис. 4.3, если отцовская клетка лизогенна, а материнская †н, то репрессор содержится в цитоплазме только первой из них. В женскую клетку переносится лишь ДНК без всяких других клеточных компонентов Фаговая ДНК, интегрированная в хозяйскую хромосому, попадает в женскую клетку, лишенную репрессора, и в результате происходит активация фаговых генов Оригинальныс эксперименты по вирулеитности, иммунности и зиготной индукции были описаны в работах Г3, 7, 34, 35), указанных в списке в конце главы Проблема репреееора в начале 60-х гг, ~3, 8) Параллельно с ранними экспериментами по регуляции генов фага ). был проведен ряд важных экспериментов по регуляции бактериальных ферментов, участвующих в метаболизме сахара лактозы.
Рис. 4.4 иллюстрируег идею о том, что продукт гспа 1ас1 представляет собой репрессор (1ас-репрессор), которыйй узнает 111с-оператор и выключает несколько генов Один из этих генов, !асУ, кодирует )3-галактозидазу — фермент, коэорый расщепляет лактозу. Было выдвинуто предположение, что сама лактоза нли какой-то продукт ее мет аболизма связывается с 1ас-репрессором и инактивирует его, включая таким образом гены 1ас-оперона. В начале 60-х гг. идеи, лежащие в основе концепции репрессора, могли оспариваться.
Например, можно было допустить (и такие соображения высказывались), что продукты генов 11 и lиг1 представляют собой не репрессоры, как предполагала гипотеза, а ферменты и катализируют другие реакции, в результате которых и образуется «истинный» репрессор. Генетические эксперименты сами по себе не могли опровергнуть это предположение, равно как не могли и разрешить споры относительно молекулярной природы репрессора. С самого начала предполагалось, что репрессоры связываются непо- Гены 1ас ИИИИИ~~ Ф иптг Рнс 44 Гены 1ас-оперона 1ас-Репрессор выключает три непа, которые считываются в виде одной молекулы РНК н кодируют ферменты метаболизма лактозы Соединение ИПТГ (изопропилтио+галактознд) напоминает лактозу и индуцирует все трн нсна одновременно Прн связывании с индуктором рспрессор не разрушается, а модифицируется таким образом, что теряет сродство к оператору 1аг-Рспрессор осушествчяст только негативную регуляцию, н коднруюший его ген 1ас1 все время транскрибируется с малой эффективностью Па рисунке не изображен НАК, который помогает полнмеразе связаться с промотором и начать транскрипцию в присутствии сАМР, если свободен 1а«-промотор средственно с операторными участками ДНК и выключают транскрипцию генов.
Но высказывались и другие, нс менее правдоподобные идеи. Например, оператор мог транскрибироваться как часть молекулы мРНК, а за1ем, в соответствии с одной из гипотез, репрессор должен был связаться с мРНК и выключить ее трансляцию. Стало ясно, что необходимо выделить продукты регуляторных генов. Исследователи надеялись, что особые свойства этих продуктов в экспериментах 1п чйто позволят выяснить механизм их действия. В 1966-1967 гг. удалось выделить (ас- и ).-репрессоры. Ниже мы вкратце остановимся на экспериментах, посвященных ).-ренрессору, чтобы показать, насколько плодотворным может быть сочетание генетических и биохимических подходов. Выделение ренрессора и его связывание с ДИК ) 53, 541 В основе метода, который был первоначально использован для выделения ).-репрсссора, лежали следующие соображения: репрессор присутствует в клетке в ничтожных количествах (несколько сотен молекул на клетку по сравнению с десятками тысяч молекул обычного фермента); никакого способа определения его активности не существует; его молекулярная природа неизвестна, если не считать того, что он хотя бы отчасти является соединением белковой природы.
Идея опыта, проиллюстрированная на рис. 4.5, состояла в том, чтобы заразить две разные культуры клеток Е, сод двумя штаммами фага ).. Эти штаммы различались только тем, что один из них мог образовывать репрессор (г1+ ), а другой ~сГ) — нет. Клетки являлись лизогенами по фагу ). и, следовательно, содержали Х-репрессор, который должен был выключи~ь все гены инфицирующего клетки фага, за исключением гена с1. Кроме того, клетки перед заражением облучили большой дозой УФ-света, чтобы внести повреждения в ДНК клетки-хозяина и тем самым подавить синтез клеточных белков.
Репрессор, который присутствовал в облученных клетках, представлял собой мутантную форму, которая в отличие от репрессора дикого типа не инактивировалась при облучении. После этого, как предполагалось, одна из зараженных культур клеток должна была бы синтезировать только один новый белок, ).-репрессор, а другая, инфицированная мутантом с1, не должна была синтезировать ни одного нового белка. Действительно, когда одну из культур пометили зН- лейцином, а другую — '"С-лейцином, затем клетки смешали, 90 Заражение фатом Л явного типа Лоцавпенне зн аииноннспоты х сГ нспоты Смешивание н раитуиенне нпетон Разаепенне пенное путем нроыптограинн на напонне 3 о а т о.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
