Пташне - Переключение генов - 1988 (947309), страница 22

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 22)

Согласно первой, связывающийся белок каким-то образом меняет конформацию ДНК, н она становится более подходящим субстратом для РНК-полимеразы. Вторая модель, наоборот, предполагает, что связанный белок стимулирует транскрипцию, контактируя с полимеразой. Против первой модели существует одно возражение: как мы и предполагали. по данным рентгеноструктурного анализа г.-репрессор очень мало изменяет конформацию ДНК при связывании. Еще один аргумент против этой модели был получен при изучении мутантов по гену репрессора, которые обозначаются р«(от англ.

розг1гпте сопГго! — позитивная регуляция). Мутантные репрессоры рс нормально связываются с ДНК, но не могут активировать транскрипцию; такие мутанты были выделены и в случае ).-репрессора, и в случае репрессора фага Р22. Во всех случаях мутации затрагивают аминокислотные остатки. которые, как предполагается на основании структурных исследований н других данных, расположены вблизи от полимеразы и, возможно, соприкасаются с ней.

Таким образом, данные по этим мутантам служат дополнительным подтверждением справедливости наших представлений о комплексах репрессоров с операторами в тех двух случаях, о которых идет речь. На рис. 4.27 указаны фосфатные группы, которые предположительно контактируют с полимеразой, связанной с Р„, и с ).-репрессором. связанным с Ор2 и Ок!. Когда эти белки исследуют по отдельности, и с )-репрессором, связанным с Ок2, и с полимеразой контактируе~ один фосфат. Следовательно, этот фосфат расположен скорее всег.о вблизи от участка взаимодействия между двумя указанными белками.

Если мы поместим димер репрессора на 0„2, то обнаружим, что измененные аминокислотные остатки всех р«-мутантов Х-реггрессора расположены на том участке поверхности, кото- 124 Олагии фосц3лт области контакта -реиресслра с Пюорлтами Области иалтаиза РИК-лелимеразы с — о з ч и†о т — ч ~ — ои! -ч ри! Рис. 4.27. Расположение х-репрессора на операторных участках Ол! и 0,2 и полимеразы на Р„м.

Боковая поверхность двойной спирали ДНК изображена в виде плоскости, побы показать все фосфаты, контактируюшзге с поли. мсразой в области Р, н с репрессором в области Ол! и 0„2. [Футпринзинг при участии ДНКазы показывает, что полимераза занимает более протяженный учасюк ДНК, чем можно судить по контактам с мими фосфатамя.

Мы всюду изображаем полимеразу с >чехом этого факта.) >25 Рис. 4,2К Мутации фага хрг Три аминокислоты. которые замещают соответствуюшие остатки в белке дикого типа. в трех мутангах хрг обведены кружками. Остатки, заключенные в ромбики. сохраняются в составе биспиральных элементов многих специфических ДНК-связываюших белков. Обратите внимание, что Рг-чутагши не затрагивают ни консервативные остатки, ни остатки узнаюшей спирали.

рый, если судить по положению общего с полимеразой фосфата, обращен к полимеразе !см. рис. 2.17). Как видно из рис. 4.28, мутации Хрг приводят к изменению узнающего ДНК биспирального элемента белка и затрагивают остатки одной из спиралей и области поворота, но не изменяют остатки узнающей спирали. На этом основании с учетом некоторых дополнительных соображений можно вы- Общий аюсфат г — Оеэ — У Ь вЂ” Окт — 4 Ь вЂ” Оп1 — 4 Рис 4 29 Связывание репрессора Р22 с участками Ое! и 0„2 и полимеразы с Р„„Срщшнте этот рисунок, на котором показаны фосфаты О„и Р „, фага Р22, контактируннцие с белками.

с рис. 4.27. утааип, йуюаюеюе зптпаную т пегуппааю ОА2 О„2 Мутанип, нарушающие позитивную регупяапю щии азат Р 22 Рис 4 30 Положение «обшего фосфатап. контактируюшего с полимсразай и репрессором, относительно бнспиральных элементов репрессоров фатов Х и Р22. Как и можно было ожидать исходя из различия в расположении этих репрессоров относительно полимеразы, связанной с Рп„, рс-мутации у рспрессоров фатов 2' и Р22 локализованы на разных поверхностях. сказать предположение относительно механизма взаимодействия репрессора Р22 с полимеразой. На рис. 4.29 показано, как располаг аются репрессор Р22 на участках О«! и 0«2 и полимераза на Р .

Данные получены путем идентификации фосфатов, контактирующих с белками. Обратите внимание, что ) -репрессор и полимераза расположены вдоль ДНК друг за другом, как вагоны поезда, а репрессор Р22 и соответствующая полимераза лежат на ДНК рядом друг с другом, образуя подобие бутерброда (не забудьте, что на рисунке показана плоская развертка цилиндрической поверхности двойной спирали). Обрати~с также внимание, что имеется единственный «общий» фосфат, с которым контактируют и репрессор Р22, и полимераза.

Если судить только по тому набору фосфатов„с которыми контактирует полимераза, «общий» фосфат располагается в промоторе Р22 так же, как и в промоторе Р „ фага л,. Что же касается репрессора. относительно него «общ™ий» фосфаг располагается по-иному, чем в случае фага ).. Хотя нам неизвестна структура репрессора Р22,мы все-таки знаем, какой участок его аминокислотной последовательности образует предполагаемый ДНК-узнаюший биспиральный элемент. Из рис. 4.30 видно, что если репрессор Р22 касаешься полимеразы какой-либо частью биспирального элемента вблизи «общего» фосфата, то в этом должны участвовать осгатки С-концевой части узнающей спирали.

Эта ситуация совершенно отлична от случая с ).-репрессором, который изображен на том же рисунке и в котором остатки, затронутые мутациями ре, располагаются вблизи )х)-конца узнающей спирали. Некоторые рс-мутации репрессора Р22 затрагивают сам С-конец узнающей спирали, а другие (если исходить из соображений о структурной гомологии белков)-участок поблизости от С-конца. Отсюда следует, что оба белка, осуществляюп!их позитивную регуляцию, должны связываться с одной и 1ой же поверхностью РНК-полимеразы, но участвуют в этом разные поверхности репрессоров (рис.

4.30). По всей вероятности, сушественно, что все пять выделенных к насзоягцему времени ре-мутаций у репрессоров ). и Р22 состоят в замене аминокислоты в белке дикого типа на более оснбвную аминокислоту (при этом увеличивается положительный заряд). Исследования очищенных репрессоров, содержащих рс-мутации, показали. что они нормально или близко к этому связываются с ДНК, подавляют Р, но неспособны активировать Р„ Позитивная регуляция т кйго [43з Репрессор увеличивает эффективность транскрипции с Р „ примерно в !О раз.

Этот эффект легко наблюдать, только если концензрация полимеразы не превышает определенного уровня; при высокой концентрации полимеразы Р эффективно работает как в присутствии, так и в отсутствие репрессора. Именно этого следует ожидать, если роль репрессора заключается в увеличении частоты взаимодействия полимеразы с Р „. По данным футпринтинга максимальная активация Р под действием репрессора наблюдается при такой его концентрации, когда он заполняет только участки 0»1 и 0»2. При более высокой концентрации заполняется также 0»3.

и Р подавляется. Если промотор содержи г мутантные О» 1 и 0» 2 или если мутаггген только 0„2, никакой стимуляции Р „под действием репрессора не наблюдается. Если мутантны О»1 и О» 3, стимуляция Р и возможна, но она происходит при более высокой концентрации репрессора, чем в случае интактного участка 0„1.

Напомним, что, если 0„1 несет мугацию, 0„2 слабее связывает репрессор. Выделенный !ч-концевой домен репрессора также стимулирует Р и щ у1уо, и !и »1!го; в этом случае эффект не зависит от того. несет ли О» 1 мутацию. Напомним, что Х-концевой домен связывается некооперативно. Результаты экспериментов, описанных в предыдущих разделах, согласуются с представлением о том, что репрессор, связанный в 0» 2„стимулирует Р, контактируя с полимеразой, связанной с этим промотором.

Однако здесь возникает следующее возражение. Возможно, полимераза, находящаяся на Р„, влияет на связывание полимеразы с Р и репрессор стимулирует Р по той простой причине, что препятствует связыванию полимеразы с Р», Такая «модель конкурирующей полимеразыя может быль отвергнута с помощью различных экспериментов, Например, удаления Р„с помощью делеции оказывается недостаточно, чтобы актйвировать Р „; более того, делеция вообще не сказывается на активности Р„„как !и и»о, так и !п зч1го.

Другой эксперимент показывает, что в случае матрицы 0»2 не наблюдается сколько-нибудь заметной стимуляции Р„„. Репрессор, связанный с О» 1, препятствует связыванию полимеразы с Р„на той же матрице, но не действует на Р Более того, в случае матрицы, лишенной Р, и О 1, связыванйе полимеразы с Р„увеличивает сродство репрессора и даже его изолированного !ч-концевого домена к 0„2. Заключение В предисловии к этой кни~е мы отмечали, что многие приведенные в ней рисунки не просто иллюстрируют отдельные наблюдения.

Чаще всего (и особенно это огносится к гл. 1) они суммирую~ и интерпретируют множество разных экспери- 128 ментов. Читатель, который справился с гл. 4, в полной мере оценит это. Такой читатель замети~, например, что нам пришлось выдумать изображения мономеров и димеров интактного репрессора. Действигельно ли мономер похож на гантель? Правильно ли мы изобразили, как димеры репрессора «наклоняются», соприкасаясь с другими димерами и обеспечивая тем самым кооперативность связывания? Можно ли объяснить гибкостью цепочки, соединяющей домены репрессора, следующий довольно странный факт: при изменении расстояния между соседними участками связывания в Оя и О„на несколько пар оснований энергия взаимодействия между димерами репрессора почти не изменяется ( — 2 ккал/моль)? Эти вопросы представляют особый интерес в свете совершенно неожиданного открытия, изложенного в приложении 3: репрессоры кооперативно связываются с операторными участками, искусшвенно разделенными шестью витками двойной спирали.

причем энергия взаимодействия примерно ~акая же, как и в случае близко расположенных участков.Мы предполагаем, что взаимодействия между ДНК-связывающими регуляторными белками играют важную роль в регуляции генов у всех организмов„и нам предстоит узнать много нового о механизмах этих взаимодействий. Если структура репрессора нам известна хотя бы частично, го о структуре РНК-полимеразы мы не знаем практически ничего.

Характеристики

Список файлов книги