Пташне - Переключение генов - 1988 (947309), страница 21
Текст из файла (страница 21)
В целом структуры )х)-концевых доменов репрессора 434 и Х на удивление сходны. Так, и-спиральные участки 2 н 3 репрессоров ) и 434, образующие универсальный 119 ДНК-связывающий биспиральный элемент, в точности совпадают по своей пространственной конфигурации, а спиральные участки ! (этот участок в репрессоре фага 434 короче) и 4 почти совпадают. ДНК находится в В-форме; некоторые отклонения наблюдаются лишь на концах операторного участка, Возможно, это связано с тем, что репрессор 434 слегка изгибает оператор. По;ге«ение и свой«»ма «гибридных спиралей» г9, 38, 52, 60, 65, 663 Узнающая спираль репрессора 434, которая располагается в большом желобке ДНК в комплексе репрессора с оператором,— важнейший, а возможно, и единственный элемент, определяющий специфичность связывания.
Это следует из эксперимента, в котором структура репрессора 434 была модифицирована с целью изменения его специфичности. Мы называем этот эксперимент получением «гибридных» или «химерных» спиралей, хотя, возможно, правильнее было бы говорить о «конструировании» спиралей. Схема эксперимента изображена на рис. 4.25. Идея его состояла в том, чтобы заменить аминокислотные остатки, расположенные на наружной стороне узнающей спирали репрессора 434, остапами, которые занимают аналогичные положения в другом репрессоре — фага Р22.
инфицирующего $а!топейи. Прн этом аминокнслотиые остатки на внутренней стороне спирали оставались прежними. Что счи~ают наружной, а что внутренней сторонами узнающей спирали, разъяснено в гл. 2. Мы надеялись, что гибридная цепочка аминокислот образует и-спиральный участок, который займет нормальное положение относительно остальной части молекулы репрессора 434 и будет взаимодействовать с оператором фага Р22, но нс фага 434. Обычные репрессоры фатов Р22 и 434 не обладают никаким сродством к «чужим» операторам ни !и «йго, нн !и ч!»о. Операторный участок Р22 имеет длину 22 пары оснований: последовательность участка О„ ! фага Р22 представлена вместе с последовательностью оператора 434 на рнс.
4.25. В верхней части рис. 4.26 показано расположение аминокислот на поверхности узнающих спиралей репрессоров 434 и Р22, а в нижней — предполагаемое расположение аминокислот в искусственной узнающей спирали. Искусственный репрессор был сконструирован на основе репрессора 434 путем замены части его гена синтетическим фрагментом ДНК, кодируюгцим новую узнающую спираль. Модифицированный ген репрессора 434 присоединили к эффективному промотору. Клетки, содержащие такую конструкцию в составе плазмиды, продуцируют большое количество нужного белка. -саиыаьз о„е ЯТТТАА6ТБТТСТТТААТ ТАА*ТТСАСАА6АААТТА АСЯА6ААА6ТТТ6Т теттстттсияяся гибридная со»рань 3 Рнс.
4.25. Получение «гибридных» спиралей. Тьмннокттслоты, расположенные на наружной стороне узнающей спиратти репрессора 434, заменены аминокислотами. занимающими аналогичное положение в репрессоре Р22. -Не теи йе Наружная сторона ! бнутренняя сторона Рис. 4.26.
Узнающтес а-спирали. использующиеся в опьпах по созданию «гибридной» спирали. Три узнающие спирали изображены на рисунке так, что их ось оказывается перпендикулярной плоскости рисунка. Сравнение с рис. 2.3 показывает, что боковые еруппы аминокислот, лежащих на «наружной» поверхности, направлены в сторону ДгуК. !2! Удивительный результат этого эксперимента состоял в том, что новый белок связывался с операторами Р22, но не с операторами фага 434 как 1п к1чо, так и ш у1гго.
Поэтому клетки, содержавшие этот белок, были устойчивы к заражению фагами Р22, но не 434, а очищенный белок связывался с тремя участками О«фага Р22 с таким же сродством и в том же порядке, как и репрессор фага Р22 дикого типа. Этот эксперимент доказывает, что все структурные элементы специфичности. по которым различаются два репрессора, сосредоточены только на наружной стороне узнающих спиралей. Роль «рук» Х-репреееора ~21, 48, 64~ Струк~ура комплекса операторов с репрессором, имеющим 1~1-концевые «руки» подобно Х-репрессору, не исследована мезодом рензтеноструктурного анализа, поэтому нам приходится судить о функции «рук» на основании более косвенных данных. Эксперименты по защите от метилировапия под действием ДМС показываю~, что «руки» образуют специфические контакты со звеньями хэ в большом желобке на задней стороне спирали (рис.
4.16). При связывании с О 1 репрессор илн его 1х1-кониной домен загцищает от метилирования семь гуаниновых звеньев, Атомы 1х17 пяти из этих звеньев, которые подвергаются метилированию, расположены в болыпом желобке на передней с~ороне двойной спирали, а два а~ома 1ч7 в положениях 8 и 9 «смотрят» в большой желобок на задней стороне.
Если удалить аминокислотные остатки 1 — 3 из интактного репрессора путем конструирования нового гена или из его Х-концевого домена с помощью расщепления папаином, образуются репрессоры, которые защищают от метилирования голько О, расположенные на передней стороне спирали. Удаление трех концевых звеньев приводи~ к уменьшению связывания интактного во всем остальном репрессора с оператором в 30 раз, а при удалении шести звеньев сродство уменьшается по крайней мере на три порядка. Генетические эксперименты также указывают, что «руки» репрессора образуют как минимум один специфический контакт с задней стороной ДНК.
Так. наличие мутации в О„! по положению 8 снижает сродство репрессора, имеющего нормальные «руки», но не влияет на репрессор„лишенный трех 1х1-концевых остатков, Таким образом, «руки» вносят свой вклад как в энергию, так и в специфичность связывания. Исследования свободного, т.е. не связанного с оператором, репрессора с помощью ЯМР показывают, что «рукн» имеют гибкую, подвижную конформацию. 122 Специфические контакты шиииокислот с основики.чми [6, 18, 28, 46, 61~ Построение детальных моделей взаимодействия репрессора и Сто, основанных на данных об их структуре, позволяет прелположить, какие контакты возникают между узнающими спиралями и парами оснований оператора.
Одно из затруднений на этом пути состоит в том, чтобы установить точное взаимное пространственное расположение а-спирали и ДНК. Например, на рис. 2.11 прелполагается. что Бег в положении 2 а-спиралей обоих белков контактирует с основанием в положении 4 оператора. а 1.ув в положении б контактирует с основаниями в положениях 5 и 6. Согласно более ранней молелн. а-спираль Сго сдвинута так, что Бег и Еуа когпактировали соо гвезсгвенно с основаниями в положениях 3, 4 и 5 оператора.
Простое рассмотрение молелей не позволяет решить, какой из вариантов расположения спирали правильный и соотвеэсгвуег лп вообще какой-либо из них действительности. Эксперимент, в котором использовали специа.п,но скопс1— руированные мутантные белки и мезилировы1п1е с ш1м п~п,ь ДМС, частично подтверлил модель. пзоб!эыжеш~' ю рис. 2.!1, а именно что Бег в положении ' узны~ошсп! аш!1ы ш взаимодействует с основанием в цо.южсшш 4 оперы ~ оры Нуклеотидные последовательности ~снов репрессоры и Сто модифицировали таким образом, чтооы онн кодировали мутантные белки. Оба мутанта содержали в положении " узнающей спирали А1а вмешо более объемного и совершенно иного по своей химической природе остатка Бег.
Мутантные Сто и репрессор получили в очищенном ниле и использовали в опьпах !п чйго. Было проведено сравнение мутантных белков с белками дикого типа по их способное~и защищать ДНК от метилирования. Этот эксперимент в принципе аналогичен опыту с использованием эзилнитрозомочевины (см. ранее). Он состоит в том, что вначале проводят метилирование оператора при помощи ДМС так, чтобы на одну молекулу ДНК приходилась одна метильная группа, а затем добавляют репрессор или Сго.
Операторные фрагменты, связавшиеся с белком, задерживаются на нитроцеллюлозном фильтре, н метилированные основания в них идентифицируют с помощью расщепления и гель-электрофореза (ср, этот подход с тем, который проиллюстрирован на рис. 4,15). Если метилирование какого-либо основания препятствует связыванию белка, полоса в геле. соответствующая определенному положению в операторе, отсутствует. Этот эксперимент показал.
что метилирование О в положении 4 оператора подавляет связывание репрессора и Сто дикого типа, но не оказывает никакого лействия на связывание мутантных белков. Оба мутантных белка связываются слабее, 123 чем их аналоги дикого типа, но метилирование основания в положении 4 не влияет на связывание мутантиых белков. Метилирование же других оснований оператора подавляет связывание как мутантных белков, так и белков дикого типа.
Репрессор активирует транскрипцию гена «1, связываясь с Оа2 н контактируя с полнмеразой своим Х-концевым доменом (рис. 1.12, 1.19, н 2.17) Мупгаггии, ггарушиюгггие позипгивггую рееуляиию ~24, 25, 27, 52~ Для объяснения механизма стимуляции транскрипции каким- либо ДНК-связывающим регуляторным белком можно предложить две гипотезы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
