Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 146
Текст из файла (страница 146)
Как уже мы рассматривали в гл. 20, каноническая, или усредненная, последовательность имеет вид Леван граница Правая граница Э»зон "А 0 0 ТА А 8 Г" Инт»ан-.бну и С А 0" якзан Стрелками обозначены связи, сплайсинг которых приводит к превращению предшественника в зрелую РНК, но, являются ли они действительно сайтами сплайсинга, 326 Часть У11. Созревание РНК: процессинг Транскрннцноннвн единица области всадник генов Транскрипции Цнтоплавма Трвнскрнпцнл Спладсннг Цнтоплвама Транскрнпцнл х х / усЯггбртзгзй 3 7(7 ф 7 ф ЗЧ-40 р~ 76, ~ьъ ~ м 0 ,,Ю 72 ф зч-во. $~ встроанным чужеродным б' 3 геном % Я 7 Г,- 4 1 зяб~'~~~~ ЮФ'- оу г А р (( г" Ъ~ ьц."табзг Рис. 26зй Послеловазельиости вектора Ътг-40, в единицах транскрипции которых иа месте поздних генов находятся прерывистые гены другого организма, траяскрибируются, подвергаются нормальному ецдайсиигу, и конечные продукты экспор.
до сих пор не установлено, поскольку не изучались концевые последовательности промежуточных продуктов. (Во многих случаях"наличие повторяющихся последовательностей приводит к тому, что сайты сплайсинга не могут быть однозначно установлены на основе только последовательности нуклеотилов; в случае самой канонической Последовательности стрелки можно сдвинуть на одно иди два основания влево от каждой границы.) Тщательное изучение нуклеотидных последовательностей границ сплайсинга показывает, что единственное их общее свойство-наличие таких коротких канонических последовательностей. Они находятся на границах зкзон — интрон чрезвычайно большого числа видов организмов, от животных до дрожжей. Но никакого другого существенного сходства не удается выявить лаже при рассмотрении отдельных групп интронов (таких, как интроны определенного вида животных,интроны семейства генов и т.д.).
Могут ли такие короткие последовательности обусловливать специфичность протекания сплайсинга? Мы знаем, что по крайней мере в некоторых случаях на двгОадацнл Ьтаграднрумт талька накоторыв гвны1 у, I ! тируются в цитопдазму. Когда встроенный фрагмент представляет собой непрерывную кДНК, представддющую геи, транскрипции происходит, но в некоторых случаях образующийся продукт расщепляется в ядре (см.
также текст). границе экзон — интрон не требуется присутствия нуклеотидной последовательности значительного размера. Например, делеция нуклеотидной последовательности вируса оУ-40, при которой удаляются почти все нуклеотиды левее левой универсальной последовательности, не мешает ее использованию при сплайсинге.
Для того чтобы установить, является ли термин «граница сплайсинга» синонимом термина «каноническая, или усредненная, последовательность», необходимо проводить дальнейшие исследования такого рода. Известно, что границы зкзон— интрон не всегда функционируют независимо от присутствия других последовательностей. Деления небольшого участка нуклеотидной последовательности вируса ЯУ-40, захватывающая участок, находящийся на расстоянии 200 п.н.
от левой границы сплайсинга, может препятствовать ее использованию при сплайсинге (возможно, в результате изменения конформации РНК). Аналогичным образом иис-мутации, нарушающие сплайсинг интрона гена Ьох дрожжевой митохондриальной ДНК, могут быть локализованы на некотором расстоянии от границы сплайсинга (гл. 20). 327 26. Механизмы сплайсннга РНК Экзан Интрон Экзон ингчь з ч нн и 1 гг 1 1 Рвконатрунния Экзон Гибридный интрон Экзон югЬЖРСьбййчтбкрйЖЖ1згтэбазглэбоз% %~~~~'б'.тбЬзбтзбтз'.Гибридный ген н гг Транскрипцию РНК.предшественник П гг Сппайаинг РНК-продукт I и г обозначают левую и правую границы оплайаинга Рис. 26зь Спдайсниг транскрнптов, полученных ив послсдова- тГозЧЬИОСТЯ, СКОНСтРУИРОВаННОй ПУТЕМ СШИВаНИЯ ЗКЗОИОВ ДВУХ разных генов, протекает нормально.
трон заменяется на АТ, приводя, по-видимому, к нарушению образования мРНК. При (э з -талассемии наблюдается значительное снижение содержания В-глобиновой мРНК и синтеза (3-глобина. Но образующиеся мРНК и белок, по-видимому, являются нормальными. Для изучения природы этого дефекта были клонированы некоторые гены, обусловливающие возникновение В+-талассемий. В одном случае при 1з+-талассемии имеется единственная точковая мутация, находящаяся на расстоянии 21 п.
н, от правого конца малого (первого) интрона. Она приводит к замене нуклеотидного основания О в последовательности дикого типа на А; в результате образуется мутантная последовательность Дикий тип ьз Интран — Экзон с с т дт т д а т с тд т т т т с с с д с с с т т д а а с т Мутант г гг гз Транакрилчнп П н Сплаиа н Делечн» лик гзгз Половина экеат т ИНПЮН Г Энваир ИНПЮНЕ Эк врсртзрсбхючбчгзьрбббрбрмсбсббббббзмсРзбсбцб . Транакрнлнил Сплзйаннг гег ! н обоз ачают левую разую тра нн сплананнга Предположение о том, что канонические последовательности-этой сайты, узнаваемые при сплайсннге, было высказано лишь за неименй(ем 'лучшего' 'объяснения.
Но важная роль этих последовательностей непосредственно подтверждается существованием некоторых точковых мутаций, затрагивающих канонические последовательности и влияющих на сплайсинг. Такие мутации были обнаружены в случае талассемий человека, при которых нарушается образование либо сб-, либо 1э-глобинов. (Имеется много причин возникновения талассемий; некоторые из них рассматривались в гл. 2!.) При и-талассемии образование мРНК, соответствующей П2-гену, нарушается в результате делеции пентануклеотидной последовательности на левой границе интрона 1.
В этом случае не обнаруживается стабильной РНК. Во-талассемия, при которой не происходит образования 1з-глобина, возникает в результате точковой мутации в канонической последовательности. В результате этой мутации динуклеотид ОТ на левой границе экзон- -ин- Рис. 26,10. Экзоны Е и С объединяются при спэайсннгс в слу- чае лслеции левой границы ннтроин 2, но нс тогда, котла сна интвктиа.
Экзон Г Интрон Г зкюн у,г Интран Я Экзан С тааттИтИюч бъйббтбб~тбгктсччртбс С~ Энзон Игпрон Экнтн »,О~бгч... Зб н ттбтЗЯгь гтэбт.,-чсччз .,Стчпч лк Гул П 1 1 328 Часть ЧН. Созревание РНК: процессинг Последовательность, содержащая мутировавший сайт, практически идентична последовательности, содержащей границы сплайсинга; мутация приводит к тому, что шесть из семи оснований оказываются гомологичными.
(А различающееся основание занимает положение, в котором и в нормальных сайтах сплайсинга других б-подобных генов глобнна находятся разные нуклеотидные основания.) Обратите внимание на то, что последовательность, состоящая из семи нуклеотидов, захватывает и область справа от сайта сплайсинга, не входящую в состав участка универсальной последовательности правой границы экзон — -интрон. Из-за такого сходства сплайсинг осуществляется по мутантному сайту вместо нормального. Это имеет место у больных талассемией и при экспрессии клоннрованного шна в культуре клеток обезьяны или человека. Вплоть до 90% молекул предшественника РНК подвергается сплайсингу по мутантному сайту вместо нормального. В тех немногих случаях, когда сплайсинг происходит по нормальному сайту, это приводит к образованию активной ()-глобиновой мРНК, обнаруживаемой у больных.
Мы не знаем, почему мутантный сайт используется с большей эффективностью; возможно, это обусловлено тем, что он располагается ближе к левой границе интрона или вследствие некоторых особенностей конформации РНК. Прн образовании мутантной РНК снижается общая эффективность сплайсинга; кроме того, в ядре накапливается предшественник РНК, вообще не подвергавшийся сплайсингу. Отсюда следует вывод, что нарушение сплайсинга интрона ! может привести к нарушению сплайсинга интрона 2 (это согласуется с данными о том, что интрон ! удаляется первым; см.
ранее). Возможно такой эффект обусловлен особенностями вторичной структуры РНК. Что происходит с РНК, образовавшейся в результате неправильного сплайсинга? Это до конца еще не установлено, и не исключено, что все зависит от конкретных обстоятельств. У больного талассемией такая РНК не накапливается в цитоплазме ретикулоцитов. Из этого следует, что либо предшественник РНК или продукт неправильного сплайсинга нестабилен либо нарушен ее транспорт из ядра в цнтоплазму. Однако в клетках культуры ткани РНК, образовавшаяся в результате неправильного сплайсинга, транспортируется в цитоплазму столь же эффективно, как и нормальная мРНК.
Не известно, присоединяется ли она к полисомам, но если и присоединяется, то на ней транслируется аномальный белок, синтез которого терминируется преждевременно. (Осуществление сплайсинга по мутантному сайту приводит к появлению в данной рамке считывания бессмысленного кодона.) Необходим ли сплайсинг для образования мРНК, кодируемых прерывистыми генами? (Известно, что в случае мРНК, кодируемой непрерывными генами, нужды в нем нет.) Использование в качестве вектора вируса БЧ-40 позволяет непосредственно сравнить экспрессию прерывистого и непрерывного вариантов одного и того же гена, Прерывистый ген в этом случае представлен фрагментом генома; непрерывный ген представлен кДНК, соответствующей мРНК.
В тех случаях, когда транскрипционная единица не содержит границ сплайсинга, она нормально транскрибируется. Но в некоторых случаях (например, в случае глобиновой мРНК) образующаяся мРНК оказывается нестабильной, как было показано ранее на рис. 26.8. Следовательно, можно предположить, что судьба транскриптов определенных ядерных генов с преры- вистым строением может быль двоякой; они могут подвергнуться сплайсингу и затем транспортироваться в цитоплазму или же деградировать в ядре. Для других генов этого не наблюдается, и они могут в равной степени успешно экспрессироваться, имея как прерывистое, так и непрерывное строение. Участвуют ли в сплайсинге малые ядерные РНК? Изменения сплайсинга, вызванные мутациями, приводящими к появлению или разрушению канонических последовательностей, указывают на то, что эти последовательности сугцественны для узнавания границ экзон — ннтрон. Но до сих пор все еще не ясно, как иыенио узнаются такие последовательности.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
