Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 143
Текст из файла (страница 143)
Две транскрипционные единицы идентичны, и при экспрессии каждой из них образуется 358-предшественник РНК, на 3'-конце которою находится последовательность 265-рРНК. При инкубации изолированных макронуклсусов интрон может удалиться из предшественника. Он накапливается в виде линейных фрагментов размером 400 нуклеотидов, При более длительной инкубации эти фрагменты превращаются в кольцевые молекулы РНК. Описанные события проиллюстрированы на рис. 26.5. Мокнут ли они быть воспроизведены при инкубапии вьщсленного предшественника РНК в системе ш уггго? Поразительный результат был получен при выделении' лом. В частности, важную роль, по-видимому, играет узнавание таких структурных особенностей предшественника, которые сохраняются и в зрелой тРНК.
Это согласуется с тем наблюдением, что зрелая тРНК конкурентно ингибирует сплайсинг предшественника, по-видимому, тем, что узнается ферментом (ферментами) сплайсинга. Необычный сплайсинг рРНК Те~~аБупгеггс~ Ген, кодирующий 265-рРНК у некоторых шгаммов теггагтутела ггтегшоргттга, прерывается одним интроном. Ситуация с этим геном необычная. Диплоцпный геном ?еггагтушела сосредоточен в мииронуклеусе, в то время как в макронуклеусе происходит амплификация генов. В ре- з СЫ АО АО СС Аф с Од О А 0 А А С 0 А О 0 О С А А ОС Предшественник рнкту' 1антикодон СОД! Предшественник из клеток гцз 4 (антикодон ООА1 Предшественник из мутантных клеток э122 1на границе экзон — интран А заменяется на С1 Рис.
26Л. Три варианта дрожжевой тРНКтт' имеют разную конформапию области аитиколоиа предшественника с преры- вистым строением. СС ДО АО СС дуд с дд ОС пс ОА АО А С 0 А О С ОАО СС АО АО АФ С дА О О С Од АО пс ОА 0 С О О д 321 26. Механизмы сплайсинга РНК ерзсзэрпссоччкж. зуосеыепебсшегчетьсеезэрччгхтеерьр трецскрцццця Осрззоцзнце + «ояьцевсв формы Спязесцнг 363.РНК Е:ф Гея .~зяектрафорез Зез-РНК ЗМ.РНК 3%-РНК Иягроц, и ложия кольцевое строецш Линейный ицгрс» Рнс 2б.з. Сплпйспнг 355-предшественника РРНК Теггайушела можно изучать с помощью гель-электрофореэа.
355-предшественник рРНК образует в геле повально широкую полосу. Удаление интроне обнзруживзется по появлению узкой полосы с боль- шой полвижностью. (В полосе 353-рРНК изменений не обнаруживается 355-предшественника РНК. Его сплайсннг происходил в присутствии только моновапентного и дивалентного катионов и ОТР. Это означает, что вместе с предшественником РНК должен был выделиться некйй фермент, осуществляющий сплайсинг. Но метод выделения предшественника" включал использование фенола, обработку протеазами (разрушающими любые белки) и применение такой химической обработки, которая также должна была разрушить все присутствующие белки.
Принято считать, что при таком методе выделения не может сохраниться нн один белок. В результате остаются две возможности, каждая из которых а рпоп представляется достаточно маловероятной. Ферментативной активностью, необходимой для протекания сплайсинга, может обладать фермент, который действительно очень прочно связан с РНК (возможно, с помощью ковалентньтх' связей), сохраняя свою активность и после такой жесткой обработки. Илн же никакого фермента сплайсинга вообше не существует, а возможность протекания реакции обеспечивается свойствами самой молекулы РНК. В таком случае молекула РНК должна иметь специфическую конформацию, при которой соответствуюшие связи располагаются непосредственно по соседству, делая возможным автономное осуществление реакций разрыва связей и «сшиваниягл Наличие способности к такому осуществлению сплайсинга предшественником РНК, транскрибировавшимся на копиях гена, клонированных в клетках Е.
сой, указывает на то, что действителъно эта способность — свойство самой РНК (хотя ш Иуо в этой реакции может принимать участие и белок). Самой реакции присущи некоторые необычные свойства. Уникальное свойство-потребность в нуклеотиде, содержашем гуанозин; он не может быть замгейен 'нйкаким-другим"осйбванием.
Но присутствие трифосфата не обязательно; в реакции могут быть использованы ОТР, ОГУР, ОМР и сам гуанозин. Следовательно, хотя в реакции участвует остаток О, это не обусловлено энергетическими потребностями. Гуанйновый"нуклеотид должен содержать 3'-гидроксильную группу.
В том случае, когда гуаниновый нуклеотид несет радиоактивную метку, она включается в вырезанный ли- вследствие незначительного уменьшения ее рзэмерав по срзвнениго с ис«одной шириной. Свободиык экзонав не нзблюлзется.) Когда интрон приобретает кольпевую форму, его электрофоретическея подвижность уменьшзется, кзк вилно из более высокого положения соответсгвуюшей полосы. нейный интрон. Оказалось, что остаток О связан с 5'-концом интрона при помощи обычной фосфоднэфирной связи.
Это свойственно каждому фрагменту, освобождающемуся при сплайсинге. Когда реакция сплайсинга продолжается щ уйго, линейный интрон приобретает кольцевую форму. Реакция включает присоединение 3'-конца интрона к сайту, расположенному на расстоянии 15 нуклеотндов от его 5'-котша (концевой участок размером 15 нуклеотцдов, включающий дополнительный остаток О, удалкется).
Формально эту реакцию сплайсинга можно считать эквивалентной реакции переноса фосфоэфирных связей, как показано на рис. 2б.б. Гуаниноный нуклеотид служит источником свободной 3'-гидроксильной группы, на которую переносится 5'зкойец интрона. За этой реакцией может последовать вторая айалогнчная реакция, в которой 3'-гидроксильная группа, образовавшаяся на конце первого экзона, используется для его присоединения ко второму экзону.
Эти два переноса, по-видимому, сопряжены. Поскольку в реакции не обнаруживается свободных экзонов, их сшивание-скорее всего составная часть той же самой реакции, при которой удаляется интрон. Образование интрона с кольцевым строением можно объяснить другим переносом фосфоэфирной связи, при котором разрываетск связь, находящаяся на расстоянии 15 нуклеотидов от 5'-конца, а освободившийся 5чконец переносится на 3'-гидроксильную группу молекулы интрона. (Можно пронести параллель между этой реакцией и катализируемой топоизомеразой реакцией переноса 3'-ОН-группы на 5'-Р-конец, не сопряженной с расходом энергии (гл. 32). РНК как катализатор: расширение понятия биохимического катализа В биохимии глубоко укоренилось представление о том, что только белки обладают ферментативной активностью.(Однако следует вспомнить и о том, что приверженцы представления о белках как молекулах, осушествлкющих все нажные функции, считали, что только белки могут быть генетическим материалом!) В основе 322 Часть ч'П.
Созревание РНК: процессинг разумного объяснения идентичности ферментов с белками лежит убежденность в том, что только белки с многообразием их трехмерной структуры и множеством белковых групп обладают гибкостью, позволяющей создавать активные сайты, необходимые для осуществления катализа биохимических реакций. Однако при изучении двух систем процессинга РНК обнаружилось, что это слишком упрощенное представление. В состав описанной выше системы сплайсин1а рРНК Тегганутвоа ш чпго не входит никакого добавленного пзвне белка, и приведенные свойства системы наглядно демонстрируют, что способность к сплайсннгу-внутреннее свойсгнво самой РИК.
Такое свойство было названо автокатализом, поскольу РНК сама обеспечивает свою перестройку. Она не катализнрует реакции с участием других молекул. Мы делаем заключение о том, что РНК1 по-внднмому,"может образовывать специфическую втори пгую (третичную) структуру, при которой соответствующие группы располагаются друг рядом с другом таким образом, что реакции, показанные на рис. 26.6, становятся возможными.
Хотя реакционная способность — несомненно, свойство самой РНК, протеканию реакции )п чгчо могут способствовать белки„ функция которых-стабилизация структуры РНК. Еще более веское доказательство в пользу способности РНК к автономному сплайсннгу было получено прн изучении рцбацуклеазы Р, эндонуклеазы, участвующей в процессннге тРЙК Б. сой (рассмотренном в гл. 25). Рибонуклеаза Р может диссоцнировать на два компонента: РНК размером 375 оснований и полипептнд с молекулярной массой 20000 даль~он. В условиях, обычно используемых для исследования активности фермента ш ч1Гго, оба компонента были необходимы для расщепления тРНК-субстрата.
1; Но изменение ионного состава среды -увеличение концентрации ионов Мй'' — делает ненужным присутствие белкового компонента. Каталнзировать реакцию может н одна РНК) Если интерпретировать эти результаты, считая, что функцию фермента выполняла РНК, то получится, чзо каждый такой «фермент» каталнзнрует расщепление по меньшей мере четырех субстратов. В самом деле, оказалось, что активность РНК не намного меньше активности неочищенных препаратов рибонуклеазы Р.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
