Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 139
Текст из файла (страница 139)
Как и все нуклеазы, рибонуклеазы ,'можно разделить на два класса: экзоиуклеазы и эндону'клеазы. Эндонуклеазы расщепляют определенные связи вйугври молекул РНК, что приводит к образованию дискретйых фрагментов. Эти ферменты участвуют в реакциях разрезания, в которых нуклеотидные последовательности зрелой РНК отделяются от фланкирующих последовательностей. Экзонуклеазы удаляют остатки с конца молекулы по одному, в результате чего образуются мононуклеотиды. По способу воздействия на субстрат они могут быть разделены на ферменты, действующие случайно или последовательно. Фермент.
воздействующий на субстрат случаиным образом, удаляет азотистое основание из одной молекулы РНК и затем диссоцннрует из комплекса с РНК; при осуществлении следующей каталитической реакции фермент может атаковать либо ту же самую, либо другую молекулу РНК-субстрата. Последовательное воздействие на субстрат означает, что фермент остаемся связанным с одной и той же его молекулой, удаляя основания одно за другим до полного осуществления своей функции.
Экзонуклеазы участвуют в реакциях подравнивання молекул РНК. Ненужные основания отщепляются от молекулы РНК-субстрата по одному. Все охарактеризованные к настоящему времени экзонуклеазы движутся вдоль цепи нуклеиновой кислоты начиная с 3 ьконг(а, Это означает, что таким способом может быть удален избыточный материал, находящийся на 3'-конце, но материал на 5'-конце может быть отделен только путем разрезания. Помимо участия в специфических реакциях созревания рибонуклеазы осушествляют деградацию «избыточной» РНК. К «избыточным» молекулам относятся зрелые РНК, которые уже выполнили свои функции, а также материал, который образовался при разрезании предшественников, В частности, должны быть разрушены мРНК, время жизни которых истекло (время жизни бактериатьных мРНК короче, у эукариот оно длиннее, но в очень редких случаях мРНК достаточно стабильна, чтобы существовать в течение длительного периода времени).
Можно предположить, что рибонуклеазы, участвующие в таком превращении, менее специфичны, чем рибонуклеазы, участвуюшие в определенных реакциях созревания, поскольку их функция заключается в полном разрушении РНК, а не в образовании специфических концов. К этому классу рибонуклеаз относятся и эндорнбонуклеазы, и экзорибонуклеазы.
В некотором смысле, конечно, деградация РНК до мононуклеотндов представляет собой завершающий этап ес созревания, приводяШий к повторной утилизации ее компонентов в соответствующих метаболических путях, На самом леле рибонуклеазы сильно различаются по своей специфйчйости.' Не известно нн одной рнбонуклесайй кбторая бы воздействовала на последовательность из нескольких нуклеотндных оснований субстрата.
Поэтому их нельзя считать аналогами рестриктируюших иуклеаз (рестриктаз), узнающих специфические последовательности ДНК. Многие 'рибонухлеазы обладают некоторой небольшой специфичностью в том смысле, что онн Расщепляют фосфодиэфирные связи в местах расположения определенных оснований. Однако они, по-видимому, значительно более специфичны по отношению к конформации РНК-субстрата. Узнавание субстрата может состоять в обнаружении специфических особенностей вторичной структуры (таких, как наличие шпилек определенного размера) или в реакции на вторичную нли третичную структуру в целом (что, по-видимому, характерно для процессинга тРНК1 Е.
со)! — единственный объект, для которого есть надежда получить достаточное количество данных для определения всего набора клеточных рнбонуклеаз. В этом случае не только можно изучать ферменты бнохимически, но также можно определить их действие 1п»1»о путем селекции бактерий с мутацией по синтезу определенного фермента. В действительности часто бывает необходимо использовать оба подхода, чтобы установить различие между ферментами или показать, что два совершенно разных вида активности присущи одному и тому жс ферменту. (Возможно, со временем аналогичные данные будут получены н для дрожжей.) Мы пока еще точно не знаем, каково число рибоиуклеаз в клетках Е.
со)); к настояшему времени известно менее 10 ферментов. По-видимому, путем сочетания активностей небольшого числа рибонуклеаз обеспечивается необходимый набор реакций при процессинге рРНК и тРНК. Хотя мРНК подвергается активной деградации, 311 25. Образование стабильной РНК О Основание этот процесс до сих пор представляется трудным для изучения, и мы все еще не имеем подробной информации об участвующих в нем ферментах. Фосфодизфирные связи могут расщепляться с обеих сторон Нуклеазы различаются как по своей ферментативной активности, так и по субстратной специфичности.
Фосфодиэфирная связь, связывающая два нуклеотида, в принципе может быть разорвана с любой стороны от фосфатной группы (рис. 25.1). Внесение разрыва по одну сторону от фосфатной группы приводит к образованию 3'-гидроксильных и 5'-фосфатных концов. Разрыв связи с другой стороны приводит к образованию 3'-фосфатных и 5'-гидроксильных концов. Две рибонуклеазы, Т! и панкреатическая рибонуклеаза, имеют практическое значение, хотя их физиологическая роль и не изучена.
Оба фермента относятся к эндорибонуклеазам, расщепляющим довольно простые последовательности. Рибонуклеазу Т! получают из Аярегд11)цт огусае (но она имеется и у других грибов и бактерий). Эта рибонуклеаза гидролнзует связь у законна остатка О. Таким образом, она расщепляет следующую последовательность: б'...Рйрнрнр1Чрнрнрнр1ярнр1ярорнр(яр(т) Зт с образованием продуктов .р1ЧрНрмр1Чр!Чрнрнрыр!Чрнрбр б'НО-1ер!Чр1Ч . 3' Обратите внимание, что в результате образуются новые концы: 3'-фосфатный н 5чгидрокснльный. Такие же концы образуются при действии панкреатической рибонуклеазы, расщепляющей фосфодиэфирную связь у 3'- конца пиримидиновых оснований. До того как появились современные методы определения последовательностей нуклеиновых кислот, эти ферменты использовали для расщепления РНК до олигонуклеотндов, анализом которых можно было определить нуклеотидную последовательность всей молекулы. В силу своей низкой специфичности они, по-видимому, ответственны за леградацию РНК !и чтчо.
Этим может объясняться и то, какие типы концов они образуют. В естественном состоянии все молекулы РНК полярны; при этом на Зчконце находится гидроксильная группа, а 5'-конец фосфорилирован (на нем может находиться трифосфат, монофосфат илн даже «кэп». в зависимости от того, был ли изменен первоначальный 5'-конел, и если был, то как). Ферменты, участвующие в процессинге РНК, образуют такие же концы. Таким образом, воздействие на РНК всех ферментов, рассмотренных в этой главе, как разрезаюших молекулу изнутри, так и отцзепляющих концевые нуклеотиды, приводит к образованию 5'-фосфаизых и 3'-гидроксильных койцов. РНКаза 111 «вырезает» ранние мРНК фага Т7 из полицистронного продукта транскрипции Почти все бактериальные мРНК транслируются в том же виде, в котором они образуются при транскрипции.
Большинство из них полнцистронны, некоторые моноци- О При расщеплении а этом — ° ° г* ° "- Р при Раощеппении а этом О Оонааание Рис. 251. Природа новых концевых участков определяется том, с какой стороны была растпеплояа фосфодизфиряая связь. стронны, Исключительная ситуация имеет место в случае ранних генов фага Т7, В этом случае при транскрипции образуется полицистронная мРНК.
Но затем молекула расзцепляется по нескольким сайтам с образованием мРНК, соответствующих индивидуальным генам. (Аналогичное расщепление, возможно, происходит н в случае поздней РНК, но этот процесс менее изучен.) Такой вид экспрессии помимо фага Т7 обнаружен и у фага Т3. Поскольку нуклеотидиые последовательности ДНК двух данных фагов совершенно различны.
наличие обзцего пути созревания мРНК указывает на то, что он обеспечивает определенные преимущества при отборе. Но нам не известно, почему у этих двух фатов существует такой уникальный вариант процессинга. В гл. 9 мы упоминали об образовании индивидуальных мРНК путем разрезания полицистронных РНК, образующихся в процессе транскрипции вирусов эукариот. В этом случае нам ясна цель: получение моноцистронных мРНК, которые могут быть транслированы. Однако нам ничего не известно о механизме этого процесса.
Транскрипция области ранних генов фага Т7 проиллюстрирована на рнс. 252. Инициирование транскрипции происходит на одной из трех групп промоторов (А1, А2, АЗ) и продолжается до терминатора (1), расположенного на расстоянии 7000 н.и. Эта область охватывает шесть генов, и для образования пяти индивидуальных мРНК (четырех моцоцистронных и одной двухцистронной) молекула разрезается по границам между цистронами. Разрезание молекулы осуществляется РНКаюй Н1. При транскрипции ДНК фага Т7 зп ч)!го РНК-полимеразой Е. сод образуется одна молекула РНК большого размера, соответствующая всей области ранних генов. Опа может быть расщеплена очищенной РНКазой 111 па индивидуальные мРНК, обнаруживаемые )п ч)чо. Мутации у бактерий (называемые глс ), инактивирующие РНКазу 1П, ш Ичо блокируют процсссннг, Поэтому в мутантных клетках гпс ДНК фага Т7 транскрибируется с образова- Часть У11. Созревание РНК: процессииг 3! 2 Промааор» Ганы ь1 Рг АЗ О,з 1 13 1г 1З 0,1 Н циации Тарминации РНКааа Ш РНКааа В РНКааа В РНКааа 1В РНКааа ж Рррро Сон 1З мРНК Оонрв сон»С 1,1 Л,Х мрНК Рроро — Оонос — Ц,нос П «ОЛ мРНК "онР" О,Т 1 мРНК онк нием такой же большой молекулы предшественника, как и гп тхйго.
Несмотря на то что в мутантной бактериальной клетке-хозяине предшественник остается нерасщепленным, 1п »1»о он может быть транслнрован и в виде полицистронной мРНК; в результате образуются обычные ранние балки.и таким образом осуществляется процесс инфекции. Успешная экспрессия ранних генов фага Т4 в гпс мутантах усиливает наше сомнение в необходимости расщепления. Однако известно, что оно необходимо в случае трансляции двухцистронной 1,1/1,2 мРНК. У мутантных фагов с нарушенным процессом расщепления, когла в состав 1,1111,2 мРНК входит 29 дополнительных оснований, кодируюшне белок участки РНК не транслируются. Причина заключается в том, что более длинная мРНК приобретает вторичную структуру, при которой не может осуществиться инициация транскрипции кодируюшей области 1,1 (а нарушение трансляции кодирующей последовательности 11 в свою очередь нарушает трансляцию области 1,2).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
