Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 142
Текст из файла (страница 142)
В каждом случае в сос~ав гена входит один интрон, расположенный на расстоянии одного нуклеотида от Зсконца антикодона. Длина интронов варьирует от !4 до 64 п.н. Нуклеотидные последовательности интронов генов, кодирующих тРНК для одной аминокислоты, сходны между собой, но у интронов генов, кодирующих тРНК для разных аминокислот, сходство отсутствует. Канонической доследоватввьнасти, которпл могла бы узнаватьсд ферментами слвайсинги, не имееп!ся. Однако все интроны содержат последователь-) ность, комплементарную антикодону тРНК.
Это приводит к изменению конформации антикодоновой ветви, при которой основания антикодона спариваются, и в результате ее длина увеличивается. Пример такого рода приведен на рис. 26.1. Меняется только ветвь антикодона, остальная часть молекулы сохраняет свою обычную структуру. Такам образом, в основе сдлайсанга ле- 1 1 ! 1 1 1 1 ! Сей с)п де и и. :с А "С А О у 'пц А А 1 ! ! ! 1 1 ! 1 1 1 с:. Й А! Ц си А,од П С!пи А с * ц:. с А: 0 А! и у с А А А А А НН Антииодон Ня Инерон зр рнк Предозеоеееннии, имоощий прериииоеое строение Рнс 26.1. Спаривание интрада дрожжевой тРНКни с антикодоном приводит к изменению структуры антикодоиовой ветви.
зюат, до-видимому, узнавание вторичной структуры определенного тина, а ке определенной нукдеатидной последовательностита. Удобный объект для изучения сплайсинга — температурочувствительные мутанты дрожжей, у которых не удаляются интроны, и в ядре накапливаются предшественники тРНК, имеющие прерывистое строение. Пррцессинг фланкируюших последовательностей может происходить обычным способом. Молекулярный механизм возникновения этого дефекта неясен, но известно, что он специфичен для прерывистых генов, поскольку тРНК, кодируемые непрерывными генами, могут созревать и трвяспортироваться в цитоплазму.
Это свойство оказывается очень полезным, поскольку позволяет выделять предшественники тРНК в такой форме, когда единственное отличие их нуклеотидной последовательности от последовательностей зрелых тРНК состоит в наличии интронов. (У предшественников могут также отсутствовать и некоторые модифицированные основания.) Затем такие молекулы используются в качестве субстратов в бесклеточной системе, полученной из клеток дикого типа. За сплайсингом предшественника можно легко проследить очень просто — определяя степень уменьшения размеров образовавшегося продукта.
Об этом уменьшении свидетельствует изменение положения полосы РНК при гель-электрофорезе, как показано на рис. 26.2, Такое уменьшение размеров, по-видимому, объясняется появлением полосы, соответствуюшей интрону. Для изучения сплайсинга тРНК можно использовать бесклеточную систему. Реакция ш енто требует присутствия АТР, и ее можно разбить на два этапа, осуществляя сплайсинг в отсутствие АТР. Первый этап включает расщепление фосфодиэфирной связи, протекающее как необычная нуклеазная реакция.
На втором этапе происходит образование связи; эта реакция называется асшнваннемр (лнгироваинем), а осуществляюший ее фермент' называется РНК-лнгазой. До сих пор не известно, присуши ли нуклеазная и лигазная активности одному ферменту или разным ферментам. Две стадии реакции сплайсинга изображены на рнс, 26.3.
В отсутствие АТР нуклеазная активность приводит к расщеплению предшественника по двум концам интро- 26. Механизмы сплайсинга РНК 319 Р жт муторных дрожжевых клеток пои высокон тампермуре в деление тРНК Лраджес с клерон додавим ие — + ескл тотног екстракта на клеток Л логотипа Геп алактрортмма ,в' лредшестве ник ,,т. ' синтроном Зрепел трнК йййа Интрон Рис.
26.2, Сплвйсннг дрожжевой тРНК (в гйго можно изучать 5 помощью гсль-злоктрофорезв предшественника тРНК н продуктов снлвйсннга. на. В результате образуются две «половинки» молекулы тРНК и линейная промежуточная последовательность. Эти промежуточные продукты имеют необычные концы: на 5'-конце имеется гидроксильная группа, а на Зчконце— фосфат. (Как упоминалось в гл.
25, все другие известные ферменты процессинга РНК расщепляют фосфатную связь с другой стороны.) При добавлении АТР осуществляется вторая реакция. Основания двух половинок тРНК спариваются с образованием тРНК-подобной структуры. Под действием РНК- лигазной активности происходит ковалентнос «сшиваыиеат двух половин путем образования фосфодиэфирной связи. Для осуществления лнгазной реакции необходимо наличие 3'-концевого фосфата. Циклическая фосфатная группа раскрывается и образуется 2'-фосфатный конец.
Эта реакция, по-видимому, требуе~ присутствия циклофосфат-диэстеразы. В состав продукта входит 2'-фосфатйауг труппа' н ЗчОН-группа. 5'-ОН-группа, образовавшаяся под действием нуклеазы, должна превратиться в 5'-фосфатную. Обычно это происходит путем обычной киназной реакции, в которой донорной группой служит у-фосфат АТР. Первый этап лигазной реакции — активация фермента АТР с образованием аденилированного белка. Фосфатная группа АМР ковалентно связана с аминогруппой белка. Освобождение АТР из комплекса с ферментом сопряжено с самой реакцией лигироваиия, Если эта реакция протекает по тому же пути, что и ранее описанная реакция РНК-лигазы Т4, она будет включать два этапа.
Сначала осуществится перенос АМР с фермента на 5'-фосфатную группу с образованием 5'-5'-фосфатной связи. Затем в результате атаки со стороны 3'-ОН-группы другой половины тРНК происходит вытеснение АМР. Обратите внимание, что фосфатная группа, сйязывающая два экзона, исходно не входила в состав РЙК, а во время реакции была перенесена с АТР. Молекула после сплайсинга становится ковалентнонепрерывной с наличием 5'-3'-фосфатной связи в сайтс сплайсинга, но она также содержит 2'-фосфатную груп- пу — маркер осуществления сплайсинга. Эта лишняя группа, по всей вероятности, удаляется фосфатазой.
(На промежуточных этапах сплайсинга ее присутствие может быть полезным для обозначения сайта сцзивания.) Образование 2'-3сциклического фосфата пе является уникальным свойством дрожжей. Такая циклическая группа возникает при сплайсннге тРНК у растений и млекопитающих. Реакции ее образования у растений и дрожжей, по-видимому, нс различаются. Однако у млекопитающих осуществляется другая реакция. В клетках человека (Неа а) лигаза непосредственно присоединяет конец РНК с 2'-3'-циклофосфатной группой к концу РНК, несущему 5'-гндроксильную группу.
Сплвйсинг предшественников дрожжевой тРНК может осугцествляться также н в экстракте, полученном из зародышевых пузырьков (ядер) ооцитов Хенорцз. Из этого следует, что реакция не является видоспецифической. У Хенория, по всей вероятности, имеются ферменты, способные узнавать интроны дрожжевых тРНК.
Особенности строения предшественника, узнаваемые ферментами сплайсинга, можно выявить, внося изменения в молекулу РНК либо путем манипуляций с клонированным геном ш вйго, либо с помощью мутаций (и у(чо. На отсутствие необходимости в наличии интрона со строго определенными последовательностью нуклеотидов и размером указывает существование природных различий между генами. Это подтверждается экспериментами, прн которых в интрон встраивали дополнительный фрагмент размером 2! п.н., что приводило к увеличению длины дополнительной ветви предшественника, но не влияло на сплайсинг. Системы для изучения сплайсннга тРНК отличаются кем преимуществом, что легко могут быть получены соответствующие мутанты.
Например, существуют дрожжевые клетки, в которых прерывистый ген для тРНКтт' мутировал с возникновением охра-супрессорной мутации. Из мутантных клеток можно отобрать такие, в которых супрессня не осун(есзнвллаися. В некоторых из них отсутствует супрсссорная тРНК, поскольку мутации нарушили образование предшественника. На рис. 26гй приведены три типа структур тРНК: предшественника тРНК из клеток дикого типа, предшественника тРНК из клеток с супрессорной мутацией (который подвергается нормальному сплайсингу) н предшественника из мутантных клеток, у которых сплайсннг протекает в семь раз менее эффективно. Вторичная структура интронов во всех случаях разная.
Предшественник из клеток с супрессорной мутацией имеет укороченный двухцепочечный стебель, и один конец интрона входит в состав двухцепочечного участка, а не одноцепочечного. Мутация а122 затрагивает область разрезания при сплайсинге, приводя к образованию большого неспаренного участка в двухцепочечном стебле; другой конец интрона вследствие спаривания оснований входит в состав двухцепочечного участка, а не одноцепочечной петли.
Таким образом, сайты сплайсинга узнаются ферментами независимо от того, располагаются ли они в области спаренных оснований или одпоцепочечной области, и даже изменения на границе экзон — интрон приводят всего лишь к снижению эффективности сплайсинга и не приводят к замене сайтов сплайсинга. Это напоминает выводы, сделанные нами в гл. 7 н 25 относительно структуры тРНК и ее экспрессии. Соответственно в основе реакций сплайсинга лежит узнавание не специфических оснований, а конформации молекулы в це- 320 Часть ЧН.
Созревание РНК: процессинг Половинки молекулы рнк Предшественник 3 он 3' ,он 3 он ОН Пигэзнан активное цифически саиваю 3 фосфатный ив он ц Половинки молекулы образуют зрелую РНК с соответствующей конформацией действие н уклеазы ь 3' Интрсн — уникальный линейный фрагмент Рис. 2блй Сплвйсииг осуществляется путем иуклеазиого расщепления, приводящего к образованию патрона и двух поло- вииок молекулы тРНК, за которым следует ковалситиос сшива- ние половин молекулы с помощью лигазы. зультате амплификации образуется большое число внехромосомных линейных молекул, каждая из которых представляет собой палиндромный димер рДНК.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
