Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 145
Текст из файла (страница 145)
С увеличением числа интронов число таких вариантов должно увеличиваться, и при рассмотрении генов большего размера становится труднее понять, чем обеспечивается создание определенной вторичной структуры. Один из выводов, который следует из такого анализа, заклшчается в том, что все промежуточные продукты сплайсинга полиаленилираваны. Это означает, что обычно после завершения транскрипции и до начала сплайсинга по крайней мере к значительной части молекул добавляется фрагмент ро(у(А). В этом случае сплайсинг следует за транскрипцией, а не сопутствует ей, Однако такая последовательность событий не всегда имеет место, поскольку сплайсинг может происходить и при ингибировании поливденилирования (гл. 27). До сих пор мы предполагали, что удаление каждого интрона осуществляется на определенном этапе сплайсинга. Но это не обязательно так. В случае гена 1)-глобина мыши обнаруживается 15б-предшественник, содержащий только большой интрон. Это, возможно, означает, что первым удаляется малый интрон.
Но затем большой интрон удаляется, возможно, в два этапа, поскольку имеется промежуточный продукт, содержащий только часть этого интрона. Таким образом, пытаясь обнаружить сайты, по которым происходит сплайсинг, не следует забывать, что, хотя они и должны содержать границы экзон — интрон, другие сайты, расположенные между ними, также могут быть использованы в качестве промежуточных. Что происходит с удаленными интронными участкамиу Эксперименты по гибридизации с популяцией ядерных РНК свидетельствуют о том, что концентрация овальбуминовых интронных последовательностей примерно в )О раз ниже, чем концентрапия последовательностей экзонов, Возможно, это означает, что удаленные из молекул интроны довольно быстро разрушаются, а предшественники„идентифицируемые при Нозерн-блоттинге или при электронно-микроскопическом анализе, представляют собой популяцию более сшабцльных ядерных молекул.
Все промежуточные продукты, которые подвергаются более быстрому процессингу, будут присутствовать в относительно небольших количествах, так что обнаруживаемые предшественники — это промежуточные продукты, процессинг которых происходит медленно и которые поэтому присутствуют в более высоких концентрациях. Для полного выяснения вопроса о путях осуществления сплайсинга необходимо иметь данные опытов по вытеснению импульсной метктс в которых в течение короткого времени осуществляют включение радиоактивной метки в первичный предшественник, а затем прослеживают ее судьбу на разных стадиях созревания РНК.
Границы сплайсинга могут быть взаимозаменяемыми Для точного выяснения молекулярных механизмов сплайсинга необходимо исследовать природу границ сплайспига (границ экзон — интрон)„последовательностей, непосредственно окружаюгцих сайты разрезания и сшивания. Как уже отмечалось в гл. 20, границы сплайсинга называются соответственно их расположению в интроне.
Левая граница (иногда называемая донорной) находится 26. Механизмы сплайсинга РНК 325 на левом конце интрона; правая граница (иногда называемая акцепторной) располагается на другом его конце. Зависит ли узнавание правильной пары левой и правой границ сплайсннга от индивидуальных свойств последовательности, или оно обусловлено каким-то внешним фактором ее взаимодействия с аппаратом сплайсинга? Иными словами, присущи ли каждой паре границ сплайсинга уникальные особенности нуклеотидной последовательности или структуры, или же все левые границы функционально эквивалентны и все правые границы также неразличимы? Из нуклеотидных последовательностей границ сплайсинга н окружаюших их участков очевидно, что никакой комплементарности между соответствующими левой и правой границами нет; это исключает возможность их непосредственного соединения друг с другом путем спаривания оснований. Другая возможность состоит в специфическом попарном узнавании последовательностей на границах экзон — интрон белками или РНК.
Модели такого рода могут быть применены к митохондриям дрожжей, где сплайсинг осуществляется только по нескольким парам границ (как описано в гл. 20). В случае гораздо большего числа границ в ядерных молекулах труднее проверить справедливость таких моделей. Возникает связанный с этим вопрос о том, существует ли какая-нибудь тканеспецифичность сплайсннга РНК? Имеется ли для транскриптов всех генов единый механизм сплайсинга, не зависжций от конкретных обстоятельств, так что узнавание нужных границ сплайсинга определяется только РНК и общим для всех транскриптов аппаратом сплайсннга? Или же сплайсинг специфической ядерной РНК происходит только в тех клетках, где обычно экспрессируется соответствуюший ген? Ответы на эти вопросы могут быть получены при изучении сплайсинга предшественников РНК в различных системах клеток, а также путем конструирования искусственных генов с новыми комбинациями границ сплайсинга.
Описанный в гж 19 метод клонирования чужеродных последоватецьностей в бактериофагах или плазмидах может быть использован и для встраивания генов в эукариотические вирусы. Путем внесения необходимых разрывов рестриктазами и последующего объединения полученных фрагментов глобиновый, инсулиновый и другие гены из множества источников были встроены в эукариотическне вирусные векторы. Один из наиболее распространенных векторов-обезьяний вирус ЯЧ-40, который может размножаться в клетках ряда млекопитающих.
Новые гены могут быть встроены в область ранних или поздних генов транскрипционной единицы вируса. Их экспрессия включает стадию образования РНК-предшественника, на 5'-конце которого обычно имеются вирусные последовательности, за которыми следует последовательность встроенного гена. Такие РНК подвергаются нормальному сплайсннгу, как показано на рис. 26.8. При использовании такой системы получают важную информацию двух видов. Во-первых, правильное протекание сплайсинга не зависит от целостности природного РНК-предшественника, поскольку транскрипт встроенного гена (или иногда только его часть) может подвергаться нормальному процессингу, находясь в составе вирусных последовательностей. Во-вторых, информация, заключенная в вирусной последовательности, способна обеспечить протекание сплайсинга начиная с обычного места в клетках, полученных из другой ткани и (или) другого вида организмов. Таким образом, сигнальные после- довательности, участвующие в сплайсинге, должны быть эволюционно высококонсервативными.
При использовании подхода реконструкции генов был сделан дальнейший шаг: получены синтетические игены», в которых экзон одного природного гена соединялся с экзоном другого гена. Это схематично показано на рис. 26.9. В проведенном эксперименте первый экзон области ранних генов транскрипционной единицы вируса ЯУ-40 был сшит с третьим экзоном (3-глобинового гена мыши. Интрон такой гибридной молекулы успешно удалялся при сплайсинге. Таким образом, левая граница интрона БУ-40 (на рисунке это В) может быть при сплайсинге присоединена к правой границе интрона (3-глобинового гена мыши (область г2 на рисунке). Из этого следует, что в принципе любая левая граница сплайсинга может взаимодействовать с любой правой границей.
Парадоксальность такого заключения по сравнению с обычной ситуацией, когда сплайсинг осушествляется только по левой и правой границам одного и того же интрона, наглядно проиллюстрирована на рис. 26.10. На рисунке сравнивается экспрессия иммуноглобулинового гена дикого типа с мутантным геном, у котррого в результате делеции была удалена область, включающая границу между экзоном П и интроном 2. (Структура н экспрессия иммуноглобулиновых генов детально обсуждаются в гл. 39.) В случае гена дикого типа левая граница каждого интрона при сплайсинге соединяется только вместе с правой границей этого же интрона. Взаимодействия между левой границей интрона 1 и правой границей интрона 2 не происходит.
В случае же делеционного мутанта правая граница интрона 1 не участвует в сплайсинге и левая граница этого интрона присоединяется к правой границе ннтрона 2. Это означает, что двум таким границам при суще свойство узнавать друг друга при сплайсинге, несмотря на то что обычно прн наличии левой границы интрона 2 взаимодействия между ними не происходит. Вывод, который можно сделать, исходя нз этих экспериментов, состоит в том, что, по-видимому, все левые границы сплайсинга, так же как и все правые границы, воспринимаются аппаратом сплайсинга как одинаковые. Можно также считать, что основные свойства границ сплайсинга каждого типа относятся к обшим свойствам, присущим всем последовательностям на границах экзон — интрон. Мутации в канонических последовательностях могут влиять На СПЛайСИНГ Мы уже убедились в том, что все интроны ядерных структурных генов, кодируюших белки, можно сопоставить на основе правила ОТ...АО так, что обнаружится гомологня коротких универсальных последовательностей на границах экзон — интрон.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
