Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 144

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 144)

Поскольку мутации, затрагивающие как ген, кодирующий РНК„так и ген, кодирующий белок, могут приводить к инактивацни РНКазы Р ш ч(чо, то очевидно, что для обеспечения ферментативной активности природной РНКазы Р необходимы оба компонента. Как и следовало ожидать, было выдвинуто предположение о том, что каталнтической активностью обладает белок, в то время как РНК выполняет некоторую вспомогательную роль, например роль помошника прн связывании с субстратом (в ее состав входит ряд коротких последовательностей, комплементарных участкам тРНК, с которыми взаимодействует фермент). Но оказалось, что дело обстоит наоборот! Каким образом РНК обеспечивает создание каталитического центра? Вполне возможно, что она способна образовывать активный центр, если представить его себе как поверхность, на которой, занимая определенное положение друг относительно друга, находится ряд реакцнонноспособных групп.

В случае белка такие группы""образованы боковыми цепями аминокислот, отличающимися заметным разнообразием н включающими в себя как группы, несущие положительный н отрицательный заряд, гак и гидрофобные группы. У РНК количество доступных участков меньше, н онн в основном представляют собой группы азотистых оснований, находящиеся на поверхности молекулы. Можно предположить, что при создании определенной вторичной (третнчной) конформации в молекуле имеются некие короткие участки, образующие поверхность с активными группами.

Это создает условия для осуществления разрыва н возникновения связей в другой молекуле. Кажется несомненным, что в основе взаимодействия между РНК-катализатором н РНК- субстратом лежит спаривание оснований. Очевидно эволюционное значение этих данных.

Всегда казалась удивительной «расщепленность» генетического аппарата, во всех компонентах которого присутствует РНК, а каталнтические функции которого выполняют белки. Маловероятно, что в состав самых первых систем репликапии могли входить и нуклеиновая кислота, и белок. Однако представим себе, что первые такие системы содержали только автономно реплнцнрующуюся нукленновую кислоту, обладающую примитивными каталитическимн свойствами, необходимыми только лишь для создания и расщепления фосфодиэфирных связей. Если предположить, что участие 2чсвязей в обнаруживаемых в настоящее время реакциях сплайсинга имеет своим истоком такую примитивную каталитическую активность, то можно утверждать, что исходной нукленновой кислотой была РНК, поскольку в молекуле ДНК нет 2'-ОН- группы, н она поэтому не может вступать в такие реакции.

Но можно представить себе, что белки могли быть привнесеныы в эту систему благодаря нх свойству стабилизировать структуру РНК, которая, по-вндимому, не была надежно стабильной. Позже вследствие большего разнообразия свойств белков они могли приобрести функцию катализаторов, что в конце коннов привело к созданию изощренно сложного современного аппарата экспрессии генов.

Следы ранее существовавшей системы можно еще обнаружить. Наиболее явно они видны в случае РНКазы Р н рРНК Тегганутена. Менее очевидно их наличие в случае таких органелл как рнбосомы. Если считать, что рибосомы вначале состояли из РНК, наделенной каталитнческимн свойствами, которая затем медленно «обрастала» белками, постепенно принимающими на себя каталитические функции, и в конце концов стала играть только структурную роль, то очевидно, что два исходных компонента рибосом полностью поменялись ролями. Реакция сплайсинга РНК осуществляется в определенной предпочтительной последовательности Ряд интересных проблем, касающихся экспрессии генов, связан с существованием генов с высокой степенью мозаичности.

При их экспрессии должно быть удалено большое число интронов, а экзоны должны быть соединены в правильной последовательности. То, что реакция не распространяется последовательно вдоль предшественника, означает, что внутри предшественника РНК должны распознаваться определенные пары концов интронов. До появления метода блоттинга было практически невозможно установить соответствие ядерных предшествен- 323 26. Механизмы сплайсинга РНК Рис.

26.6. Молекулы РНК, образующиеся при сплайсингс у Те~гайутепа, могут возникать в результате реакций переноса фосфозфирных связей. ников индивидуальным мРНК вследствие незначительного содержания в клетке ядерной РНК и ее неизбежного загрязнения цитоплазматической мРНК. Использование метода «Нозерн-блоттинга» позволяет фракционировать ядерную РЙК в геле, переносить материал на специальную бумагу "и гибридизовать радиоактивный зонд со специфической последовательностью. Затем с помощью радиоавтографии выявляют полосы, положение которых позволяет идентифицировать молекулы РНК, содержащие гибридизующуюся последовательность.

(Аналогичный метод блоттинга по Саузерну показан на рис. 19.6.) Зондом, используемым для выявления полос РНК, может служить кДНК, соответствующая мРНК, или клонированная последовательность, соответствующая определенному участку гена (например, экзону или интрону). При анализе ядерной РНК из куриного яйцевода с помощью зонда для мРНК овомукоида или овальбумина в каждом случае получают ряд дискретных полос. Это само по себе указывает на то, что сплайсинг может происходить в определенной последовательности. (Если бы семь интронов каждого из этих генов удалялись в абсолютно случайном порядке, имелось бы более 300 предшественников с различными комбинациями интронов и никаких дискретных полос не наблюдалось.) Полоса мРНК самого большого размера соответ- ствует размеру гена и, по-видимому, представляет собой первичный транскрипт.

Полоса РНК наименьшего размера — это мРНК. Каждая полоса, расположенная в промежутке между ними, соответствует предшественнику (предшественникам), из которого удалены некоторые (но не все) интроны. На рис. 26.7 приведен результат анализа предшественников мРНК овомукоида с помощью Нозерн-блозтинга с основными промежуточными продуктами сплайсинга б (отсутствуют интроны Е и Г), г-д (отсутствуют интроны Е, Г, П и О) и зю (содержит только интрон С).

Дальнейшая информация о протекании сплайсинга может быть получена при помощи электронно-микроскопического анализа молекул индивидуальных ядерных РНК. Каждую молекулу гибридизуют с ДНК интактного гена, а затем определяют, какие интроны удалены. Любой удаленный интрон выглядит как петля ДНК. Результаты такого анализа приведены в табл. 26Л. Они свидетельствуют о том, что какого-либо обязщпельного порядка сплайсинга, по-видимому, нет, поскольку при анализе могут быть обнаружены промежуточные продукты, у которых интроны удалены в разных комбинациях.

Однако имеются основания предполагать наличие предпочтительного порядка протекания сплайсинга. Когда удаляется один интрон, это практически всегда интрон Е или Г. Но каждый из них может быть удален 324 Часть Ч11. Созревание РНК: процессинг Первичный тренсирипт б (!й! дф Ж)ф 3!се Отсутствие интрснсе Е и р гтю гпю гзсо Отсутствие интрснсе В,р, жш по ттсс Присутствует тсиытс интрсн С нрнк, ф - т тес Рлс. 26.7.

При анализе ядерной РНК с помощью блоттцнга цо Нозсрау ц птбридпзации с зондом, солсржашвм овомукоцлные последовательности, обнаруживается ряд дискретных предше- ственников мРНК. Таблице 26.! Ивтропы удолязотся пз впервой РНК овомупопда в предпо пп- тельвой последовательности первым. При удалении двух интронов это опять-таки чаще всего интроны Е и Р, но возможны и другие комбинации. Интрон С на первых трех стадиях сплайсинга никог- ~ да не удаляется или удаляется очень редко.

Отсюда следует, что имеется предпочтительный порядок сплайсинга, при котором первыми удаляются интроны Р и Е, затем удаляются интроны О и П; далее, по-видимому, удаляется интрон В, и последними вырезаются интроны А и С. Но очевидно, что сплайсинг может происходить и в другой последовательности, поскольку, например, в некоторых молекулах последним утрачивается интрон О или О. Интерпретировать такие результаты необходимо с лысой осторожностью, так как у нас нет никаких анных, доказывающих, что все эти промежуточные продукты действительно превращаются в зрелую мРНК; однако выдвинутые предположения вполне разумны.

Общий вывод, который можно сделать на основе такого анализа, состоит в том, что конформация РНК может влиять на доступность точек разреынйя при сплайсинге. При удалении определеннйх интронов конформация молекулы меняется, и становятся доступными новые пары сайгон сплайсинга. Но способность предшественника утрачивать интроны более чем в одном порядке указывает на то, что либо молекула может принимать разные конформации, либо при каждой конкретной конформации более чем одна пара сайтов может быть доступной разрезанию. Способность одного интрона приобретать свойственное ему строение может зависеть от событий, происхо- дящих с другими интронами.

Характеристики

Список файлов книги