Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 150
Текст из файла (страница 150)
По-видимому, после транскрипции около 20, гяРНК подвергается кэпированню. Можно обнаружить, что по меньшей мере значительная часть кэпов переходи~ из гяРНК в мРНК. Хотя полученные данные не свидетельствуют о том, что все 5'-кэпы гяРНК переходят в мРНК, наличие взаимоотношений предшественник — продукт в данном случае кажется правдоподобным. Кэпирование осуществляется сразу после начала транскрипции, о чем Ряс. 27.3. Радиоактивная метка, включившаяся как в 5'-кэды, так н в 3'-ро!у(А)-фрагменты, сначала обнаружввается в гяРНК, а затем переходят в мРНК, яо основная часть метки, включившейся в центральную часть гяРНК, оказывается в продуктах ее деградации, а за~ем повторно используется пря синтезе РНК. 27. Регуляция процессинга РНК 335 рНК-попимераэа ! Проаопженне ддсддд Кэп подвергается основная часть метки в ядре.
Но позже усовершенствование метода позволило показать, что мРНК действительно образуется из гяРНК. Резуль~аты таких жспериментов позволяют определить, какая часть общей массы гяРНК превращается в мРНК. В клетках млекопитаюшнх она составляет около 5% от всей гяРНК, что с учетом пятикратных различий средних размеров гяРНК соответствует превращению (примерно) 25% молекул гяРНК. Это означает, что уменьшением размеров транскрипта путем потери интронов можно объяснить судьбу только примерно четвертой части молекул гяРНК во всей их популяции. Остальная же часть представлена молекулами, превращения которых яолттослтью происходят в ядре: из этих молекул цитоплазматическая РНК вообше не образуется. Единственный недостаток такого анализа состоит в том, что в его основе лежит определение количества ро1у(А) '-мРНК; из некоторой же части популяции молекул гяРНК может образовываться и ро1у(А) -мРНК. Но, хотя это и приведет к увеличению количества гяРНК, приходящейся на долю предшественников мРНК, основной вывод останется прежним.
Значение полиаденилирования Последовательность ро1у(А) присоединяется к 3'-концам молекул гяРНК уже после того, как закончится транскрипция. Полиаденилирование происходит под дей-' ствием фермента ро!у(А)-полимеразы, использующего' АТР в качестве субстрата. Присоединению ро!у(А) к гяРНК может помешать аналог АТР, 3'-дезоксиаденозии, известный также под названием кордицепии. Кордицепин-специфический ингнбитор полиаденилирования. Он не препятствует транскрипции гяРНК, но его добавление нарушает выход мРНК в цитоплазму, что указывает на необходимость полиаденилирования для образования мРНК из гяРНК. (Конечно, это справедливо только в отношении ро1у(А)е-мРНК; для ро!у(А)- мРНК полиаденилирование не требуется.| Только часть молекул гяРНК полиаденилирована (около 30% в кле~ках млекопитаюших по сравнению с 70% в случае мРНК).
Часто наблюдается приблизительная корреляция между долей полиаденилированных молекул гяРНК и долей гяРНК, из которой образуются молекулы цитоплазматнческой ро1у(А)'-мРНК. Из этого можно сделать вывод, что полиаденилирование, возможно, служит сигналом для процессинга бпределенной молекулы гяРНК. Однако. хотя гюлиаденилирование и необходимо, самого по себе его, по-виднмому, еше недостаточно, поскольку в противном случае соотношение ро!у(А) в ядре и цнтоплазме было бы строго постоянно.
Один из важных нерешенных вопросов — происхожде-' ние 3'-концов, к которым присоединяется фрагмент ( ро1у(А). Мы знаем, что у некоторых вирусов эти концы образуются при расщеплении более длинных предшественников мРНК, как это показано на рис. 27.4. Общее свойство клеточных и вирусных мРНК-наличие последовательности АА1)ААА, расположенной на участке между 1! и 30 нуклеотидами левее сайта полиаденилирования. При удалении этой последовательности из «ранскрипцнонной единицы области поздних генов вируса БЧ-40 расщепление РНК и полиаденилирование уже не осуществляются по обычным сайтам.
Последовательность ААПААА необходима, но недостаточна для осуществления этой реакции. транеирипции ~инициации — Ф „нн РестзоЪЬтЗЯ ЬЖЯРЬРттЖЯЖЯОЖ6ЪХЪЬЮЫо отойхез Кдю „додкд Кэп Рнс. 27.4. Носледоватетпьность ААГ3ААА необходима лля рас- щепления н полналеннлярораняя мРНК вируса ЯЧ-40. Повсеместная распространенность сигнальной последовательности указывает на то, что тот же самый механизм — расщепление и полиаденилирование — может участвовать в экспрессии транскрипционных единиц клетки. Данных о механизме терминнрования транскрипции РНК-полимеразой 11 практически нет; поэтому в настоящее время нам не известно, в какой доле случаев 3'-конец, используемый для полиаденнлнрования, образуется в результате терминации, а не расщепления.
Полиаденилирование обычно предшествует сплайсингу РНК. При образовании клеточных транскриптов как молекулы предшественников полного размера, так и молекулы различных промежуточных размеров оказываются полиаденилнрованнымн. Изучение кинетики процес- синга мРНК, транскрибируемых на поздних генах аденовируса, показало, что расщепление, приводящее к образованию 3'-конца, предназначенного для полиаденнлнрования, преднтесптвуепт сплайсингу состоящей из трех частей лидерной последовательности, приводяшему к образованию центральной части молекулы мРНК.
(Этот процесс изображен на рис. 20.20.) Порядок осугцествления перечисленных этапов процессинга может означать, что сплайсинг-это более медленный пропесс, чем транскрипция и полиаденилирование; возможно также, что этот порядок обусловлен в определенной мере зависимостью сплайсинга от полиа- ' денилирования. Однако сплайсинг продолжается в ядрах, в которых синтез ро1у(А)-фрагментов подавлен добавлением корднцепина (3'-дезоксиаденозина). Это указывает на отсутствие механической причинно-следственйой связи между этими событиями, хотя в тех случаях, когда для сплайсинга используются альтернативные границы экзон — интрон, расшепленне с образованием 3'-конца может определять выбор границы сплайсинга (см., например, гл.
39). Получение системы полиаденилирования гп тй!го облегчает изучение этих процессов. Система работает 336 Часть Ч)Е Созревание РНК: процессннг только с РНК, синтезированной в экстракте, хотя процесс полнаденнлнровання отделен от завершения транскрнпцнн значительным промежутком времени. Это, возможно, означает, что РНК может приобрести необходимую для процессннга н полнаденнлнровання структуру только во время транскрипции, даже если само присоединение ро!у(А) произойдет позже. Реакция, протекающая 1п г(1го, ннгнбнруется антнтелами к малым ядерным РНП, в частности, антнтеламн к мяРНП. Участ.вует лн О1 мяРНП в полнаденнлнрованнн так же, как н в сплайсннге? Возможно, что Ш мяРНП непосредственно не участвуе~ в этом процессе, но входит в состав более сложной структуры, необходимой для протекания реакции.
Получена система (п И1го, прн использовании которой у гнстоновых мРНК Х. (асей (неполнаденнлнрованных) образуются 3'-концы. Прн инъекции в ооцнты Хеаориз клоннрованного гена гнстонов (ген НЗ морского ежа) успешно проходят инициация его транскрнппнн н сама транскрипция, но термннацня транскрипции осуществляется в разных сайтах.
Однако прн одновременной инъекции гена н ядерного экстракта нз клеток морского ежа транскрнбнровавшаяся РНК имеет надлежащий 3'-конец. Активный компонент ядерного экстракта — 125-фактор с мол. массой около 2,5 х 1Оз. Прн фракцноннрованнн он ведет себя как комплекс белков. Однако малая РНК нз клеток морского ежа, выделенная нз 125-фракцнн, также может вызвать образование 3'-концов, Эта РНК имеет размер около 60 п.н. (20000 дальтон). Она не имеет сходства нн с одной известной мяРНК. Повидимому ее функцноннрованне в ооцнтах Хелориз возможно вследствии наличия в ннх пула белков-мяРНП (зппгр), с которыми РНК может взаимодействовать с образованием рнбонуклеопротенновой частицы, Мы пока не знаем, на какой стадии функционирует такой мяРНП,' это может быть стадия термннацнн нлн расщеплення.
Однако участие мяРНП в этом процессе служнт веским доводом в пользу представления о том, что многие, а возможно н все, реакции процессннга зависят от взаимодействия с мяРНП. гяРНК имеют более сложную организацию, чем мРНК Исходя нз данных о различиях в размерах гяРНК н мРНК, можно ожидать, что гяРНК имеет более сложные нуклеотндные последовательностн. В случае тех транскрнпцнонных единиц, сплайсннг первичных транскрнптов которых приводит к образованию мРНК меньшего размера, сложность гяРНК определяется наличием как экзонов, так н ннтронов, тогда как сложность мРНК определяется наличием только экзонов.
К сожалению, сложность гяРНК трудно определить столь же точно, как сложность мРНК. Во-первых, нет функционального теста для выделения гяРНК, свободной от других РНК. Вовторых, возможность использования метода нсследовання кннетикн гибридизации ограничивается наличием в гяРНК повторяющихся последовательностей, которые перемежаются с неповторяющнмнся последователъностямн, образующими основную часть мРНК. Прн определении способности гяРНК к насыщающей гибридизации с неповторяющейся ДНК ее сложность оказывается больше сложности мРНК минимально в 4 раза н максимально в 1О раз. Гнбрнднзацнонные экспе- рнменты свидетельствуют о том, что популяция молекул гяРНК действительно включает все последовательности, присутствующие в цнтоплазматнческой мРНК.
Какова природа остальных последовательностей? Этот вопрос может быть сформулирован н иначе. Представляют лн собой молекулы гяРНК, полностью превращающиеся в ядре, транскрнпты с глек мсе самых генов, с которых транскрнбнруется мРНК, нлн же это транскрнпты с других генов. Этн возможности рассматрнваются на рнс. 27.5. В случае тех же самых генов в типичной клетке млекопитающих средний ген транскрнбнруется с образованием молекул гяРНК, 75, которых полностью деградируют, а у 25; молекул 20; нх длины (экзоны) переходят в мРНК. Таким образом, процессннг оказывается чрезвычайно расточительным. В рассматриваемом случае разлнчня в сложности гяРНК н мРНК полностью объясняются потерей ннтронов.
В примере с клетками млекопнтающнх сложность гяРНК н мРНК различается в четъ1ре раза, что очень близко к различиям в размерах молекул. Этн данные недостаточно точны, чтобы можно было утверждать, что все последовательностн гяРНК, необнаружнваемые в мРНК, представляют собой ннтроны, но, по всей вероятности, основная причина состоит именно в этом. Если образование молекул гяРНК, которые сохраняются нлн полностью деградируют, обеспечивается различными генами, то 75; транскрнпцнонных еднннц должны соответствовать молекулам гяРНК, все копии которых деградируют: нн нз одной нз ннх не образуется цито-) плазматнческая мРНК.
(Строго говоря, нн нз одной мо-; лекулы не образуется мРНК в клетках данного типа;: в других клетках она может н образовываться.) На остальных 25;/ генов образуются транскрнпты, все копии которых созревают с образованием мРНК (сохраняющей 20/ нх длины). В этом случае сложность гяРНК должна быть существенно выше, чем сложность мРНК, не только вследствие большей длины молекул гяРНК, но н нз-за того, что в ее состав входит набор транскрнптов, нз которых мРНК не образуется. В некоторых тканях морского ежа, где сложность ядерной н цнтоплазматнческой РНК различается в 10 раз, это различие, по-внднмому, слишком велико, чтобы его можно было объяснить только потерей ннтронов. Конечно, две приведенные модели представляют собой крайние случаи, н нет сомнения, что в реальном ядре имеет место промежуточная ситуация.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
