Методы общей бактериологии (том 3) (947294), страница 42
Текст из файла (страница 42)
Растворы для разведения более подробно рассматриваются в работе Мейнеллов [6[, а выживанию вегетативных форм микробов посвящен целый симпозиум [3). 25.2. ИЗМЕРЕНИЕ БИОМАССЫ На измерении массы бактериальной клетки часто основыва|отся измерения активности обмена веществ, а также изучение морфологических и химических особенностей компонентов клетки. Число клеток и биомасса — два самых существенных параметра бактериального роста, в то время как удельный вес — важная характеристика самой клетки.
Методы измерения биомассы представляются очевидными и прямыми. На деле же, если требуется высокая точность, они достаточно сложны. Результаты при этом могут быть выражены разными способами, а полученные величины являются скорее относительными, чем абсолютными. Об этом нельзя забывать при нх определении. 25.2.1. Сырой вес Номинальный (полный) вес сырых бактериальных клеток (сырой вес) из жидкой суспензии определяют 233 ЧАСТЬ РП. ПРИЛОЖЕНИЕ взвешиванием образца в таре с известным весом после отделения и отмывки клеток фильтрованием илн ценчрифугированием. Однако и в том н в другом случае в ннтерстициальное (межклеточное) пространство захнатывается раствор для разведения, вес которого входит в величину сырого веса биомассы, причем количество интерстициального раствора может быть существенным.
В объеме, плотно заполненном жесткими сферами, на пространство между сферами приходится 27% общего объема. Для плотно упакованных бактериальных клеток интерстициальное пространство может составить от 5 до 30% в зависимости от их формы и степени деформации. По одному из способов получения истинного сырого веса самих клеток из номинального сырого веса вычитают вес раствора, находящегося в межклеточном пространстве. Последний определяют экспериментальным путем, как описано в разд. 19.!.2.
Согласно другому способу, для которого требуется специальное оборудование, клетки частично подсушивают и затем предоставляют им возможность перейти в равновесное состояние и набрать постоянный сырой вес в замкнутой камере для взвешивания, в которой поддерживается 100%-ная относительная влажность прн постоянной температуре. 25.2.2. Сухой вес Номинальный вес сухих бактериальных клеток (сухой вес), находящихся в жидкой суспензии, определяют после высушивання пробы в сушильном шкафу при 105'С до постоянного веса.
Клетки должны быть промыты водой, в противном случае следует ввести поправку на компоненты среды нли раствора для взвешивания, которые остаются в клетках при высушивании. Отделение клеток с помощью фильтрования осложняется некоторыми трудностями (равд. 10.5). Ряд проблем возникает при их высушивании в сушильном шкафу; при этом например, могут теряться летучие компоненты клеток или может происходить некоторая деградация компонентов клетки, что хорошо заметно по обесцвечнванию (особенно при использовании высоких темпера- М РАСТВОРЪ| ДЛЯ РАЗВЕДЕНИЯ И ИЗМЕРЕНИЕ ВИОМАССЫ тур). При переносе проб и взвешивании в комнатной атмосфере может происходить некоторое обратное поступление влаги.
Поэтому все операции следует проводить быстро, в течение одного и того же времени для параллельных проб. Лучше всего, конечно, использовать сосуды для взвешивания с известным весом, которые после высушивания можно запечатать. Наиболее точные измерения производят путем высушивання проб до постоянного веса в эксикаторе, содержащем пятиокись фосфора (Р|ОЗ), при 80' С под вакуумом или лиофилизацией (равд. 12.2.1). Наш опыт свидетельствует о том, что результаты, получаемые этими тремя методами, не различаются в пределах 17з (2). Превосходное обсуждение методик определения сухого веса и возможных ошибок дает Мэллит [4].
Сухой вес можно привести к единице сырого веса (граммы твердого вещества на 1 г биомассы клеток) или к единице сырого объема (граммы твердого вещества на 1 см' биомассы клеток или на 1 см' клеточной суспензии). 25.2,3. Содержание воды Количество клеточной воды в полностью гидратированных клетках равно разности между сырым весом (равд. 25.2.1) и сухим весом (равд. 25.2.2) этих клеток Содержание воды можно также рассчитать с учетом влажности атмосферы или активности воды в растворе, где находятся клетки (равд. 6.2). Полностью высушенные клетки приходят в равновесие с атмосферой, влажность которой известна и контролируется, насыщаясь водой с постепенно возрастающей скоростью (7). Этот процесс описывается типичной изотермой сорбции, представленной на рис.
25.1. Начальная фаза сорбции воды, происходящей при очень низких значениях влажности, соответствует прочному связыванию воды, поглощаемой в виде монослоя; фаза промежуточного плато соответствует непрочному связыванию воды, поглощаемой в виде множества слоев; конечная фаза, имеющая место при высоких значениях влажности, отражает поглощение большей части раствора — так называемой свободной воды.
Общее количество воды в полностью 235 ЧАСТЬ ЧП. ПРИЛОЖЕНИЕ 400 гидратированных клетках получают при 1000!а-ной влажности. Однако точное измевение этого количества затруднено в связи с кру- 0000 тым наклоном изотермы сорбции. Оценивать количество клеточной воды иногда удобно, измеряя количество 4 гоо проникших в клетки 020, "С-мочевины или 1АС-глицерина (разд. 19.1.5) с уче- Х том поправки на межкле- точное пространство. 3 Рою Количество клеточной воды можно привести кединице сырого веса (граммы воды на 1 г сырого веса), к единице сухого веса (грамо оо но мы воды на 1 г обезвоженОп~пааагпепаная бпалспаап1а % ных клеток) или к единице сырого объема (граммы воРнс 25д. Тяннчная наотерма ды на 1 см биомассы клесорбцня волы лля бактсрнвлы ток), Бактериологи чаще ных нлатак.
всего используют приведе- ние к единице сырого веса, хотя наиболее фундаментальным является приведение к единице сухого веса. Переход от содержания воды по отношению к сухому весу (СВ,т,) к содержанию воды по отношению к сырому весу (СВ, р) выражается уравнением: СВст, СВ, р/(1 — СВ. Р). К примеру, 400 ~~ сук = 80 7а с яр. 25.2.4. Объем Объем биомассы клеток (или средний размер отдельной клетки) лучше всего определяется по методике, описанной в равд. 19.1. зз.
Рлствогы для Рлзведения и измеРение Биомлссы 25.2.5. Плотность сырого и сухого вещества Плотность вещества бактериальной клетки (собственно удельный вес) определяют либо как плотность сырого вещества, рассчитываемую на полное содержание твердых и жидких компонентов, либо как плотность сухого вещества («химическая плотность>), рассчитываемую на содержание только твердых компонентов. Обе величины выражаются в единицах веса, приходящихся на единицу объема (граммы на 1 см').
Плотность сырого вещества получают простым делением сырого веса клеток (равд. 25.2.1) на занимаемый нми объем (равд. 25.2.4). Сходным образом можно вычислить плотность сухого вещества, поделив сухой вес клеток (разд. 25.2.2) иа занимаемый сухими клетками объем. К сожалению, этот объем трудно определить точно. Сначала клетки полностью высушивают, например лиофилизацией (равд. 12.2.1). Чтобы удалить поглощенный газ и остаточные пары воды, довольно большие количества (больше 2 г) высушенных клеток выдерживают в условиях высокого вакуума до тех пор, пока давление не выйдет на постоянный уровень при значениях меньше, например, чем 0,01 мкм рт. ст.
(-1,33 мПа). Затем с помощью адсорбционного волюметра измеряют объем инертного нли непоглощающегося клетками газа (например, гелия или азота), который выходит из них. Этот метод был испытан Берлином и др. [Ц на бактериальных спорах. Соответствующее оборудование имеется в продаже (геегшпе1ег; Оа!1агс(-ЗЕЫез(щег, 1пс., Саг!е Р1асе, 5(У 11514). Плотность сухого и сырого вещества оценивают с помощью равновесного центрифугирования в градиенте плотности (равд. 5.2.3). Однако использование этого метода для клеток, а не для субклеточного материала сопряжено со скрытыми трудностями. При определении таким способом плотности сырого вещества гидратированных клеток (например, в растворах метризамида и ренографина) активность воды и осмотическая сила имеют по ходу градиента разные значения; к тому же градиентный раствор может проникать в водное пространство матрикса клеточной стенки.
При определении 237 пасть чп. пРилОЖЕНие этим способом плотности сухого вещества высушенных лишенных газа клеток (с использованием таких пар растворителей, как перхлорэтилен и 4-грег-бутнлтолуол) градиентный раствор может экстрагнровать линпды клетки нли сам растворяться в них. 25.3. ЛИТЕРАТУРА 1. Вегаса Е., Сиггал Н. !г., Ра))апвсЬ. РЬузгса! зиг(асе 1еагигез апа сЬеписа! 6епв11у о( агу Ьас1ег!а1 врогев.
3. Вас1ег!о!., 86, 1030— 1036 (1963). 2. В!оса В. Н., Оегаагг(1 Р. РегспеаЬгщу о1 Ьас1епа1 зрогез !У. ЪЧа1ег соп1еп1, ир1а(ге, апд й!в(г!Ьи1!оп. 3, Вас1епо1., 83, 960 — 967 (1962). 3, Оглу Т. !г. О, Роя!Еа(е А А'. (ег(.). ТЬе вигчгча! а1 чеие(а1(че ппсгоЬев. Вупгр. 5ос. Оеп. М!сгоЬ!о1, 26, 1 — 432 (1976). 4. Макене М.
Е. Еча!ианоп ог Егойгь Ьу рьунса! ап~! сьсгп га! гпеапз. 1п: 3. К. 1(огг!з агн! Р. тУ. К(ЬЬопз (ед.), Ме1Ьо6в !и писгоЫо!оку, чо!. 1. Асадепг!с Ргезз, 1пс., Ыею Уог1г (!969), 5. Магдеия Н. Е., Оегаогг(Г Р. Ро!упгег1зед огиап!с вайа о( зиноп1с асыз ивег! аз 61зрегв1пк аКеп(в !и пг!егории!оКу. Арр!. М!сгоЬ[о!., 7, !05 — !08 (!959).
6. Марлен О. О., Марлей Е. ТЬеогу апд ргас1!се !и ехрег!пгеп(а! Ьас1ег!о!оКу, р. 25. СагпЬгЫде Оп!чегз11у Ргезз, Ыеп Уог)г (1970). 7. Тгоиег А А., Саггяггал А Н. В. %а1ег аскчку апд 1оо6. Асабегп!с Ргевз, 1пс., Хечг Уог(г (!978). УКАЗАТЕЛЬ ЛАТИНСКИХ НАЗВАНИИ Римской цифрой обозначен том, арабской страница Васййиз П1: 75 — сегеия 1 2 ! 9 239 Асе!оЬастег асей 1: 215 Асйо!ер!аята !аЫ!агой 1: 222 ЛсЫат!пососсиз !еттеп1алз 1: 217 Ас!пе!обасгег са!соасейсиз 1: 2!7; Пг 66, 69 — 75 Асйпобасй!иь йуп!егезй 1г 2!5 АсйпоЬЦЫа сйсласотгса !: 220 Асйлотусез Ьоой 1: 220 Лсгигор1апез рййгрр!пепсйз 1: 220 Аегососсиз нггЫапь 1: 218 Аеготопаз Ьуйгорййа 1: 216 АугоЬас!ейит гаг!!оЬасзег П[г 29 Аугобас!епит гй!гоуепез 1: 2!5 Аугобас!ег!ит !ите!ас!ель П1: 29 Лтоебассег газель 1: 213 Атогрлозрогалу!ит аигалйсо1ог 1: 220 Атрийаг!ейа геуи!аг!з 1: 220 Лиса!отйгоЬ!ит айе!ит 1: 2!4 Аеиаьрзпйит 1: 228, 303 — 305, 308 — 309, 324 — угасйе 1: 228, 308 — 309 — йегьолй П1: 19 — зегрель П!: 19 Агаслп!а ргорЫ!са 1: 220 Лгсйалу!ит уерйуга 1: 2!3 Аг!Ьгоуас!ег гепеуепз 1: 220 Аьйссасаийз ексепййсиз 1: 2!4 Лготопаз 1П; 21 — ауй!з 1: 215 Агояр!гуйит 1: 307 — 308; П: 69 Ага!оЬас!ег 1г 75 — 76, 200, 307 — 308, 325; П1: 20, 21 — сйгоососсит 1: 215 — 7азйа!азиз 1: 283 — тасегапя П1: 15 — 16 — раззеигй 1: 283 — 284 — ро!утука П!; 15, 1б — ритйиз Ш; 169 — зрйаепсиз П1 34 — ьгеагогйегторбй!из П1; 169 — зиЬййя 1: 219, 299; П: 65- бб; П1: 43, 169 Вас!спинета тазгисаогй 1: 220 Вас!гмоЫез соггог!епь П1: 22 — 7гауй!з 1: 216 — те!апЫоуписиз П!: !5 — огайз Ш: 15, 22 — гипигйсо!а 1: 216 Ваг!опейа ЬасПЩогт!з 1: 22! Веуу!азоа 1: 286 — а!Ьа 1: 213 ВеЦеппс1йа П1; 21 ВеЦеппсййо гпсйса 1: 215 Вг7!йоЬассеггит ЬЦЫит 1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
