Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 48
Текст из файла (страница 48)
Поэтому часто необходима высокая эффективность счета и внесение поправок на тушение, рассчитанных на основе многократных измерений. 246 1О Физические методы 16.4.3. Жидкостные сцинтилляционные счетчики Хотя сцинтилляционные счетчики стоят довольно дорого, в настоящее время они широко используются наряду со счетчиком Гейгера или газовыми счетчиками для измерения радиоактивности 'Н, "С, "5 и "Р. Это объясняется тем, что при счете в них устраняется самопоглошение образца и обеспечивается высокая эффективность счета. К тому же в случае счета с помощью сцинтилляции образцы приготовить довольно просто.
В сцинтилляционном счетчике регистрируется импульс света, возбуждаемый в флуоресцирующем веществе в результате акта радиоактивного распада. Этот импульс обнаруживается с помощью пары фотоэлектронных умножителей (ФЭУ) и регистрируется. Два ФЭУ работают по схеме совпадений, благодаря чему в них происходит почти полное подавление «шумов». ФЭУ преобразует световые импульсы в импульсы напряжения, причем амплитуды последних строго пропорциональны интенсивности первых, а следовательно, и исходным энергиям возбуждающих сцинтилляцию частиц. Регулируя с помощью дискриминатора пороги амплитуд импульсов, можно просчитывать только те импульсы, которые попадают в «окно»,— интервал, ограниченный задаваемой минимальной и максимальной энергией излучения. Таким образом, прибор можно настроить на 1) отсеивание многих фоновых импульсов с низкой энергией, 2) избирательный счет импульсов одного изотопа (одного класса амплитуд) или на 3) счет всех изотопов (всех амплитуд импульсов).
В современных приборах такую настройку осуществляют одновременно в нескольких параллельных каналах анализатора. Радиоактивное излучение преобразуется в сцинтилляцию с помощью молекул растворителя, которые возбуждаются под действием этого излучения, а затем передают энергию возбуждения флуоресцирующему соединению (флуорохрому, или собственно сцинтиллятору). Возбужденный флуорохром либо излучает импульс света с определенной длиной волны, либо передает энергию возбуждения вторичному флуорохрому, который в свою очередь излучает импульс света в более приемлемой для регистрации области спектра.
2,5-дифенилоксазол (РРО) 247 члстыш метаболизм и 1,4-бис-2- (5-фенилоксазолил) бензол (РОРОР) и его дпметильное производное — наиболее распространенные первичные и вторичные флуорохромы, называемые собственно сцинтилляторами. Они представляют собой не- полярные вешества, которые для получения сцинтилляцпонного раствора обычно растворяют в неполярных растворителях, например в толуоле. Главный недостаток сцинтялляцнонного счета заключается в трудности введения в неполярный раствор водных образцов, содержащих полярные растворенные вешества.
Кроме того, вода н полярные растворители снижают эффективность счета, т. е. онп наряду с окрашенными соединениями тушат сцинтилляцию. В связи с этими трудностями разработаны различные сцинтилляционные смеси для полярных н неполярных веществ в растворс, для твердых ве. шсств и т. п. (см. ниже). Кроме того, в счетчике может регистрироваться высокий фон из-за флуоресценцпи нлн фосфоресценции, индуцированной солнечным светом, для исчезновения которого иногда требуется несколько часов или дней. Источником ошибок и высокого фона может быть также хемолюминесценцпя. Уровень фона может повышаться из-за 4'К, содержащегося в стекле, из которого сделаны флаконы для счета. Вместе с тем некоторые вещества, например ТХУ, НС104, вода, пирндин и окрашенные соединения, тушат сцинтилляцию, Твердые вещества В сцннтилляторе можно просчитывать небольшие кусочки бумаги или кусочки сорбента с тонкослойных пластинок.
Основные трудности, которые прп этом возникают, связаны с самопоглошением частиц, разной ориентацией образцов, неодинаковой солюбилизацией радиоактивного материала. а также с использованием внешнего стандарта для определения эффективности счета (см. ниже). Поскольку прямого способа определения самопоглошення не существует, можно определить лишь относительную радиоактивность ряда образцов в одинаковых условиях. Вариабельность в счете уменьшается, если радиоактивное вещество полностью растворяется или совершенно не растворяется в сцинтилляционном растворе. Например, для извлечения аминокислот и и ьизнчвскнв методы сахаров из бумаги используют гидроксид гиамина 1О-Х в метаноле, а затем пробы просчитывают в толуоле.
Если радиоактивное вещество нельзя полностью элюировать с бумаги, можно сжечь ее и измерять радиоактивность СО, в составе органического основания или карбоната натрия (или бария). При просчитывании кусочка бумаги, содержащего нерастворимую радиоактивную фракцию, наиболее воспроизводимые результаты получают в том случае, когда он лежит на дне флакона. Большие преимущества имеет использование дисков и полосок из стекловолокна, поскольку при этом повышается эффективность счета: с тритием она равна 10ь74 при воспроизводимости +-бь(ь, тогда как при использовании целлюлозных дисков она равна 2 — 8%. В случае более сильных источников излучения, например '4С, воспроизводимость экспериментов и эффективность счета еще выше.
Полиакриламидные гели Основной проблемой является быстрая солюбилнзация геля. Лучше всего гель солюбилизировать путем разрушения поперечных сшивок, поскольку несшитые линейные полиакриламидные цепи легко растворяются в сцинтилляционной смеси. В качестве поперсчно-сшивающего агента обычно используют Х,г)'-диаллилтартардиамид, который легко расщепляется иодной кислотой 156), Ряд гелей, содержащих 7ь7ь (вес(объем) акриламида и 0,27)ь (вес(объем) поперечно-сшивающего агента, обрабатывают 0,5 мл 2'/ь-ной иодпой кислоты в течение 2 ч.
Добавляют сцинтилляционную смесь, энергично перемешивают с помощью встряхивателя Уог1ех и используют для анализа весь раствор или отбирают из него аликвоты для счета. Сцинтилляционная смесь способствует растворению геля [551. Двуокись углерода Измерение радиоактивности '4С в составе СОе играет важную роль при изучении метаболизма бактерий, а также при проведении многих прикладных работ, где требуется сжигание нли расщепление углеродсодержа- 249 часть в мвтхволизм щих соединений. Для сцинтилляционного счета СО2 улавливают либо органическим основанием, например гидроксндом гиамина 1О-Х, применом 81-К, зтаноламинэтилсндиамином или фенилэтиламином, либо гидроксидом бария или МаОН.
Во всех этих случаях необходимы специальные емкости для основания. Основания с включенным СОз вносят в сцинтилляционный раствор и просчитывают в счетчике. Способы сжигания описаны в работе Джеффи 159). Работа с прибором Регистрация одного изотопа. Прежде всего необходимо настроить прибор. Цель настройки — добиться максимальной эффективности счета для данного изотопа при минимуме фона. Для каждого канала возможны два типа настройки: 1) с помощью регулирования верхнего и нижнего порогов дискриминатора и 2) с помощью регулирования напряжения ФЭУ и коэффициента усиления. При увеличении последних двух параметров амплитуда импульса увеличивается. С помощью верхнего и нижнего порогов дискриминатора устанавливают нужный диапазон амплитуды импульсов. Амплитудный спектр импульсов, или энергетический спектр, 8-излучения определяют путем регулирования верхнего и нижне~о порогов дискриминатора с последующей их фиксацией.
Затем просчитывают изотоп при возрастающих значениях нижнего и верхнего порогов дискриминатора, но при постоянной разнице между ними (ширина окна) 0 — 1О, 10 — 20, 20 — 30 и т. д. Кривая, отражающая счет в средней точке окна по всему диапазону дискриминатора, представляет собой энергетический спектр изотопа (рис. 16.8). Каждый изотоп имеет характерное распределение амплитуды импульсов. Очевидно, пороги в каждом канале можно отрегулировать таким образом, чтобы через него проходили импульсы из определенной части энергетического спектра изотопа, а импульсам из другой части спектра доступ был бы закрыт. Нижний порог устанавливают в положение, при котором исключалась бы ббльшая часть шума, а верхний — в положение, при котором проходят импульсы с максимальной амплитудой.
Благодаря такой !6 ФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ Ъ и и с~ $ и й с ~а диппитууа ииггуама Рнс, !6.8. Амплитудный спектр импульсов различных радиоизо- топов. Рис. 16Я. Амплитудный спектр импульсов как функция напря- жения ФЭУ. 1, 2 — нижние по- роги; 3, 4 — верхние пороги.
дмппитууа иипу мса 251 настройке исключается большая часть шумов с низкой и высокой энергией. Определяя амплитудный спектр импульсов при различных напряжениях фотоумножителя, получают совокупиость кривых (рис. 16.9), с помощью которых определяют отдельно радиоактивность каждого из двух изотопов в одном образце. При понижении напряжения интервал регулировки порогов дискриминаторов становится более узким, Во всех случаях следует определять фои, т. е. радиоактивность в сциитилляциоииом флакоие с пробой, ие содержащей радиоактивный изотоп, которую вычитают из результата счета для каждого образца.
При большой скорости счета фои ие имеет существеииого значения, однако при малой его необходимо учитывать. Счет двойных меток, Счет двух радиоактивных изотопов в смеси возможен, если оии имеют различную энергию, благодаря чему разделяются их амплитудные спектры импульсов. Такими парами являются 'Н и г4С, 'Н и 66$, 'Н и "Р, "С и "Р. Если изотоп с более высо- чАсть 1п матАБолнзм коп энергией подсчитывается исключительно в канале 1, то в канал 2 для изотопа с низкой энергией могут попадать и импульсы изотопа с высокой энергией. Поэтому необходимо измерить эффективность счета для каждого изотопа отдельно, лучше всего с помощью внутренних и внешних стандартов, а затем определить счет в канале 2 с помощью уравнений: Счет в канале ! Раси армии Эффективность счета "С в канале ! Раси 1мин аН = (С Счет в канале )— !Раси /мин 1'С ЭфФективность счета тчС в 2) канале 2 Эффективность счета аН в канале 2 Эффективность счета в канале 2 для изотопа с низкой энергией (в данном случае 'Н) можно оптимизировать регулированием порогов дискриминатора, используя стандарт, содержащий тритий.
Затем нижний порог канала 1 устанавливают таким образом, чтобы оп исключал импульсы 'Н, а верхний — так, чтобы он обеспечивал максимальную эффективность счета "С. Применение этой методики целесообразно в том случае, если эффективность счета и тушение для образца соответствуют эффективности счета и тушеншо для используемого стандарта. При тушении большая часть импульсов с высокой энергией попадает в канал для низкой энергии.
Исходное соотношение каналов, если оно известно по стандартам с подобным тушением, восстанавливают, изменяя положение порогов дискриминатора. Чтобы восстановить амплитудный спектр импульсов при исходной установке окна, можно также увеличить коэффициент усиления для ФЭУ или усилителя. Следует отметить, однако, что при низкой радиоактивности счет двойных меток сопряжен с трудностями и ошибками. Эффективность счета и поправка на тушение, Даже лучшие сцинтилляционные счетчики в идеальных условиях не позволяют обнаружи~ь все радиоактивные частицы, хотя для источников сильного б-излучения, например 14С и а'Р, достигается эффективность счета свыше 90е1о.
Эффективность прибора можно определить не- и физические методы сколькими способами с использованием иеполярной сцпнтилляционпой жидкости, пе содержащей химических и физических агентов, вызывающих тушение. Чаще всего эффективность прибора и поправку иа тушение определяют с помощью одного из трех методов, описанных ниже, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки. Метод внутренней стандартизации. Этот оригинальный метод относительно прост, надежен и точен при счете импульсов одной метки. Он требует поправки иа тушение, обусловленное присутствием в смеси химических тушителей, в том числе окрашенных соединений. Сначала просчитывают рабочий образец (С), а затем к нему добавляют небольшое количество вещества с известной радиоактивностью (Р,) и той меткой, которую измеряют, например, для счета "С добавляют "С-бензойную кислоту, для счета 'Н вЂ” 'Н-толуол и т.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
