Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 10

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 10)

Правда, прн этом способе не подавляются все ферменты, н поэтому он не всегда годится для фиксации в цнтохнмнческнх исследованиях. Ниже мы подробно опишем метод фиксации ОЯО„поскольку это один нз самых распространенных и полезных методов. Для него характерны следующие этапы. !. Приготавливают !%-ный или 2%-ный раствор четырехокнси осмия (вес/объем) в дистиллированной воде. Кристаллический реактив ОЯО, определенного веса поставляется в запаянной ампуле. Ампулу разбивают и вносят ее содержимое в соответствующий объем воды. Кристаллы растворяются медленно, поэтому приготовление нужно начинать за ! Или 2 дня до использования.

Лредрпреждснпе. ОЯО1 — раздражающий агент, его пары опасны для глаз и слизистых оболочек, поэтому с пим необходимо работать под тягой. Хранят реактив в холодном темном месте и желательно в темных склянках, чтобы предотвратить образование черного неактивного продукта. 2, Кусочки агара на предметном стекле с клетками наверху помещают в закрытую кювету с несколькими миллилитрами раствора ОЬО,. В качестве опоры для стекол используют сзсклянпые шарики, лежащие па дне Я ПРЕПАРАТЫ ДЛЯ СВЕТОВОП МИКРОСКОПИИ кюветы.

Благодаря этому предметные стекла с агаром находятся иад раствором фиксатора. 3. В течение 1,5 — 2 мин парам дают возможность адсорбироваться. 4. Предметные стекла вынимают и накрывают слой агара покровным стеклом. Покровное стекло захватывают специально предназначенным для этого пинцетом и быстрым резким движением поднимают его вверх, отделян от агара. Иногда поступают иначе: переворачивают кусочек агара на покровное стекло и резко сбрасывают его кончиком ножа, так чтобы некоторые клетки остались на стекле.

5. Немедленно опускают покровное стекло в колумбийскую кювету с 70%-ным этанолом, где его можно держать, пока все не будет готово для последующей окраски. Методы окрашивания могут быть теми же, что и для препаратов, фиксированных по Боуэну.

Как и в том случае, цитоплазма окрашивается основными красителями, такими, как тионин, а нуклеоплазма не окрашивается. Однако нуклсоплазма имеет вид более узких пятен, чем при фазово-контрастной микроскопии живых клеток. Фиксированные ОЕО, препараты пригодны для окрашивания нуклеоплазмы по Гимзе либо после гидролиза рибонуклеазой (100 мкг/мл в 1 мМ М850, в течение 30 мин), либо после гидролиза кислотой. Последний метод состоит из следующих стадий. 1. Покровпое стекло с фиксированными клетками помещают на 6 — 8 мин в 1 и. НС1 при 60 С. 2.

Отмывают его в воде. 3. Окрашивают раствором Гимзы (10 капель краски на 10 мл 0,067 М фосфатного буфера, рН 6,6) в течение 10 мин (нли более) в случае почти всех грамотрицательных бактерий. 4. Промывают буфером и смотрят в микроскоп, проверяя, нормальная лн получилась окраска. (На этом этапе хорошо помогает водоиммерсиониый обьектив, но он не обязателен.) 5.

Заключают препарат в воду или разведенный краситель. Последний вариант хорош для грамотрицательных бактерий, поскольку их цитоплазма может быть еле видна. 51 часть !. морвология Нуклеоплазма окрашивается в сине-фиолетовый цвет, а цитоплазма — в розоватый, Первая стадия этого метода, безусловно, представляет собой основу для окраски по Фельгену, и нуклеоплазма, содержащая ДНК, после гидролиза окрашивается в красный цвет реактивом Шиффа (8), Пленочные препараты, фиксированные таким способом, могут быть очень полезны при изучении изменений в клетках, подвергшихся множественной обработке в агаре или в жидкой культуре, например, во время фаговой инфекции (51. Следует обратить внимание на то, что во время фиксации нуклеоплазма реагирует на наличие в среде катионов, избыток которых приводит к конденсации хроматина (61.

2.3. ЛИТЕРАТУРА 1. Вагег [7., [(озз й, Р. А., Тасей 5. не[гас!огне!ту о[ Иыпд сеПз. 5[а1пге (Ьопдоп), 171, 720 †7 (1953). Основные положении, касаюпгиеся показателя преломления в средах при фазово-контрастной микроскопии. 2 б[гЬаой М. Е1пе а!е!зсйпИЬпе[Ьобе Иг Рпххепеп. М!сгозсор!е, 20, 254 †2 (1965). Полезные советы по пленочному прилипанню культур на предметных стеклах. 3. Мазол Р. 7,, Роме!зол х!. М. Хис!еаг б!ч!з!оп аз оьзегчеб 1п Иче Ьас1епа Ьу а пети [есьп!Чгге. 3. Вас1егю!., 71, 474 — 479 (!956). Описаны наблюдения последовательных этапов деления иуклеоидов бактерий, которые иллюстрируются фазоао-контрастными микрофотографиями, 4.

Мах[а [7., Если[[ел б., Еа(е йу. Абьеыоп о1 сена 1о зпг1асез сов[ей ъ ИЬ ро!у1ужпе. 3. Сеп Вю1., 66, 198 — 200 (!975). 5. Миггау Я, й, Е., [рйп![е!и 7. Г. Су1о!ойбса1 е![ес[з о1 Ьч1сспоп гчИЬ Т5 апб зонте ге!а[ег1 рьаяез. 3. Вас[епо1., 65, 715 — 726 (!953) Применение световой микроскопии в цитологии при изучении фагозых инфекций. 6. Миьтау [г.

6. Е., Ига[!![еЫ Л Р. ТЬе спеем а1 1Ьс гоп!с сптгоптеп! оп [Ье сйгогпа1!п Мгисйгсз о1 Ьас1епа. Сап. Ш М!сгошо!., 2, 245 †2 (1956). Наблюдения, в которых уделено особое аняманне действию катионов на нуклеоидную структуру. 7 Рапоп А, М., Магсйап! [7.

Ап и![газ[гис1пга! а!иду о1 зср1а[ дече1оргпеп1!п Ьурйас о[ Ро[урогиз Ыеааьх АгсЬ. М[сгоь!о(, 118, 27!в 277 (1978). Другой пример методика пленочного пралипаиня. 8. Ргейагзй[ 6. Ху1о1ои!асье ([п[егзпснппяеп ап Ва[г[ег!еп ~пн [и![е бег Рен1яепзсьеп Ь[ис1еа1геайл!оп. Агой. М!сгоЬ|о!., 8, 428 — 439 (1937).

52 3. ПРЕПАРАТЫ ДЛЯ СВЕТОВОИ МИКРОСКОПИИ Применение реакпин Феяьгеиа для четкого выявления очертаний бактернальных нуклеоидов. 9, )7оу!лога С. Р. ТЬе ргерага(!оп о1 уеаз(з 1ог !19Ь( ппсгозсору. Ме1Ьойз Се!! Вю1., 11, 1 — 22 (1975). Практическая рекомендация по применению желатине-агаровых культур на с~еклах. 10. !гор!понг С. Р., Миггау )7, й. Е. ТЬе б!1!егеп(!а(!оп о1 сей тта!1, су1ор!азв!с вегпЬгапе апб су1ор!азв о( ягав-розй!те Ьас1еПа Ьу зе!ес1)те з1а!п!пд, Ехр. Се!1 Вез., 4. 390 — 407 (1953) . Выявление клеточных стенок методами окраски. 11, Ясйасс)г(ег М., УП!!!алиоп У.

Р., Ноог( У. )7., Кос(г А. (.. стготт(Ь, се!! апг) ппс!еаг г)!т!з!опз 1п зове Ьас1ег!а. Л. Сгеп. М)сгоЫо!., 29, 42! — 434 (1962). Описан способ увеличения показателя преломления среды для фазово-контрастной микроскопии. Глава 3 МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ В СВЕТОВОЙ МИКРОСКОПИИ Р. Дойч Чтобы охарактеризовать ту или иную бактерию, обычно специфические морфологические детали выявляют с помощью световой микроскопии. Некоторые используемые при этом методы, возникшие еще на заре микробиологической науки, с честью выдержали испытание временем. Эти классические методы дают самую ценную информацию. Однако важно понимать методологические ограничения, касающиеся деталей формы или структуры, поскольку при любой лабораторной процедуре препарат может подвергаться некоторым изменениям, правда в большинстве случаев незначительным.

Как бы то ни было, данные, полученные при микроскопировании бактерий, необходимы, но обычно недостаточны для идентификации последних (гл. 20). Часто, однако, ошибки в идентификации происходят из-за неверных суждений о форме, результатах окраски по Граму или подвижности вновь выделенных форм. 3.1. ВЗЯТИЕ ПРОБ Наблюдать живые бактерии непосредственно в их естественной среде обитания довольно трудно. К тому же получаемая при этом информация может быть очень неполной. Для этого имеется ряд причин: 1. Не в каждой среде обитания на единицу массы приходится большое количество бактерий.

Например, чтобы получить достаточное для изучения количество морских или озерных микроорганизмов, их нужно, как правило, концентрировать пропусканием через целлюлозные или поликарбонатные фильтры или центрифугированием. 2. В некоторых средах содержится слишком много бактерий на единицу массы. Поразительное множество бактерий и других микроорганизмов вперемежку с раз- 54 з мвтоды пдвнтификлции в сввтовои микеоскопии личными частицами обнаружено в отстое сточных вод нли в фекалиях. В данном случае материал нужно разводить одним из многих имеющихся буферов с биполярными ионными свойствами. Некоторыс почвы и морские отложения содержат очень мало бактерий, причем эти бактерии смешаны с большим количеством непрозрачного коллоидного вещества, которое с трудом можно отличить от бактерий.

3. Большинство бактерий, составляющих природную флору какой-либо среды, не имеют особых отличительных морфологическнх признаков. Исключения составляют, например, звездообразный Ргоз(песот(сгобшгп, снабженный капсулой 5рпаегоИиз илн трихомы рода Сагуорйапоп. Поскольку бактерии в водной суспензии имеют оптические свойства, сходные со свойствами воды, и их трудно наблюдать с помощью обычного микроскопа в проходящем свете, пробы лучше исследовать с использованием позитивного или негативного фазового контраста или с помощью темнопольной микроскопии. Если последние варианты недоступны, нужно опустить конденсор и уменьшить освещение, чтобы повысить контраст, даваемый обычным микроскопом. При непосредственной работе с пробами, бактериологическими петлями, предметными стеклами с нанесенными на них капельками и покровными стекламн„а также во время приготовления препаратов в процессе работы с ними существует масса возможностей для бактериального загрязнения пальцев, рабочих поверхностей, одежды и оборудования.

Характеристики

Список файлов книги