1625913344-8903f4a71ad640872a209e228a3a0bd4 (531148), страница 78

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 78)

Структура и функция гена1I10 II d cI mr10SCsc11Vp a o r sc p vcxoc1| PSn1sthdcmrdcm r\sc pvscscp v lcx |sc'sc1 n 1 1 PSn1pa o r sc pcxocpa orscscstcx1noc1ncxr1st1stpvpa orochcxp a o r ls c p \scscОС I CXniIpa orhoc"_____Рис. 16.2. Линейный план гена scute — achaete D. melanogaster (по H. П. Дубинину, 1971)Слева по вертикали — номера аллелей. В квадратах — условные наименования щетинок,редуцируемых вследствие мутаций. Перекрывание аллелей показывает сходство в ихпроявлении порознь и в компаундах (см. текст). Вверху — линейный план генаИсследование в 1929-1933 гг. локуса sc-ac у D. melanogaster,показавшее, что ген не является единицей мутации, было первымпрорывом в область сложной структуры гена, которая определи­лась лишь к середине 1950-х годов. Вскоре А.

А. ПрокофьеваБельговская и Г. Г. Меллер показали и рекомбинацию между мута­циями sc-ac.Глава 16. Теория генаft 429С начала 40-х годов XX в. начали выходить работы по проблеметак называемого «псевдоаллелизма». В них развивались представ­ления о сложной структуре гена. В работах К. Оливера, М. Грина,Е. Льюиса с D. melanogaster были получены примеры рекомбинациимутаций, которые в соответствии с функциональным тестом долж­ны были считаться аллельными.

Это противоречие между рекомби­национным и функциональным критериями аллелизма и породилотермин «псевдоаллелизм».Число примеров «псевдоаллелизма» (рекомбинации между мута­циями, аллельными на основании функционального теста) быстровозрастало, особенно с развитием генетики микроорганизмов. Сталоясно, что «псевдоаллелизм» — правило, а не исключение.Так, «противоречия» между рекомбинационным и функциональ­ным критериями аллелизма послужили причиной первого кризи­са теории гена, выход из которого стал возможен только благодарятому, что сам ген стал объектом тщательного исследования.16.3. Анализ тонкой структуры генаОгромный вклад в понимание структуры и функции гена внеслиДж.

Бидл и Е. Тэйтум, в начале 40-х годов XX в. впервые исследовавшиебиохимические мутации у N. crassa. Эти исследования показали, чтомутации ауксотрофности у нейроспоры прерывают цепи метаболизмана конкретных этапах. При этом аллельные мутации всегда затрагивалиодин и тот же этап биосинтеза, осуществляемый одним ферментом.На основе своих результатов Дж. Бидл и Е.

Тэйтум сформулиро­вали принцип «один ген — один фермент», означавший, что каждыйген контролирует синтез какого-либо фермента. Этот принцип в го­товом виде формулировал дальнейшую методологию исследования:необходимо изучать не только мутанты и соответствующие гены, нои контролируемые ими белки-ферменты. Так родилось целое направ­ление в генетике — разработка систем «ген — фермент»; получениеи изучение мутантов по одному или немногим генам, исследованиемутантных белков. Все это способствовало конкретизации представ­лений о гене, его структуре и функции.В конце 1950-х — начале 1960-х гг.

XX в. структуру гена изучали наоснове рекомбинации аллельных мутаций у целого ряда объектов: эу­кариотических микроорганизмов, бактерий, бактериофагов, дрозофи­лы, мышей и высших растений. Венцом этого периода в развитии тео­рии гена стали исследования С. Бензера, работавшего с мутациями влокусе г II (г — от англ. rapid lysis — быстрый лизис) бактериофага Т4Е. coli. Мутанты типа г //образуют более крупные стерильные пятна (по430 ftЧасть 4. Структура и функция генасравнению с фагом дикого типа)на газоне Е. c o li В (рис. 16.3).1**iМутации г I I изменяют структуру•*4 *\некоторых мембранных белков в• • • *• •л ‘ Цинфицированных клетках Е. coli.# г*Особенность этих мутантов со­стоит также в том, что они вообщене могут размножаться в клетках•••9штамма Е.

coli К 12, лизогенногопо фагу X.Эти взаимоотношения му­тантов г I I со штаммами Е. coliсоздают возможность: 1) вы­Рис. 16.3. Негативные «колонии»ращивать только ревертанты(стерильные пятна) бактериофага Т4 наи рекомбинанты г+ на штаммегазоне Е.

coli (из F. Ayala, J. Kiger, 1980)Е. coli К12 (А,); 2) одновременноСтрелками показаны негативныеисследовать мутанты г I I и фаги«колонии» г* и rllдикого типа — г+ на штаммеЕ. coli В (табл. 16.1).При заражении бактериальной клетки двумя фаговыми частица­ми между их геномами возникают функциональные отношения, ана­логичные отношениям между гомологичными хромосомами дипло­ида (см.

гл. 10). При этом обнаруживается доминирование признаковнормального фага, выражающееся в образовании мелких стериль­ных пятен как на штамме В, так и на штамме К12 (X). Таким образом,между различными мутациями г I I возможен функциональный тестна аллелизм. На основе функционального теста на аллелизм выясни­лось, что локус г I I включает два гена: А и В.В ходе репликации фаговых геномов после инфекции бактери­ального штамма двумя мутантами г I I могут образоваться рекомби­нанты дикого типа. Частота появления этих рекомбинантов пропор­циональна расстоянию между мутациями в геноме бактериофага.•г•Таблица 16.1Стерильные пятна бактериофага Т4 дикого типа и мутантов г II на двух штаммах Е coliГ ен о ти п б а к т е р и о ф а г а Т 4Ш там м Е.

coliД и к и й т и п (г +)г IIВМ елкиеКрупны еКМ елкиеН е о б р азу ю тсяГлава 16. Теория генаft 431При попарном исследовании способности к рекомбинации трехразличных мутантов г II получаемые значения частот рекомбинациимогут быть использованы для линейного расположения мутаций наоснове принципа аддитивности (см. гл. 7).В пределах генов А и В локуса г II картировано более 2000 му­таций. Легко подсчитать, что если бы С. Бензер использовал толькометод попарных скрещиваний мутантов, то для точной локализациимутаций, сопряженной с их испытанием во всевозможных комбина­циях, ему потребовалось бы около 2 млн скрещиваний. Даже при ра­боте с таким объектом, как бактериофаг, цикл размножения которогодлится 20 минут, подобная перспектива выглядит удручающе.Общее число необходимых скрещиваний удалось резко сократитьблагодаря разработке метода перекрывающихся делеций.

Среди му­тантов, исследованных С.Бензером, большинство было способноревертировать к дикому типу, однако встречались и стабильные му­танты. Они же не могли образовывать рекомбинантов при скрещива­нии с несколькими мутантами, рекомбинировавшими друг с другом.С. Бензер решил, что такие «стабильные» мутанты возникли в ре­зультате выпадения целых участков локуса г II.Справедливость этого вывода была подтверждена сначала дан­ными рекомбинационного анализа: стабильные мутации (делеции),введенные в скрещивание, сокращали генетические расстояниямежду фланкирующими мутациями, т. е. расположенными справаи слева от делеций.

В дальнейшем выпадение участка ДНК проде­монстрировали при получениигетеродуплексов путем гибриди­зации ДНК из фага дикого типаи из делеционного мутанта. Приэтом участок, соответствующийделеции г II, образовывал однонитевую петлю за счет «лишней»ДНК из дикого типа, хорошо раз­личимую в электронный микроРис. 16.4. Гетеродуплекс ДНКскоп (рис 16.4).бактериофага Т4, полученный путемИспользование делеций пригибридизации молекул, одна изкартировании позволяет замекоторых несет делецию в локусенить количественный учет частоrll - г3034 (петля слева), а другаяты рекомбинации качественнымделецию Dr размером около 4800 партестом. При скрещивании точнуклеотидов (петля справа).

(Bujard,кового и делеционного мутантовMazaitis and Bautz, 1970)рекомбинанты могут появиться,432 ftЧасть 4. Структура и функция генатолько если делеция не перекрывает участок, в котором локализова­на точковая мутация. С. Бензер сначала картировал концы делецийг II по отношению к некоторым точковым мутациям, а затем исполь­зовал набор делеционных мутантов для предварительной грубой ло­кализации всех вновь получаемых мутаций г II в том или ином из 47сегментов участка г II (рис. 16.5).В дальнейшем взаимное положение мутаций, оказавшихся в одномсегменте, определяли попарными скрещиваниями. В локусе г II уда­лось выявить 308 мутационных точек, или сайтов, расположенных влинейной последовательности (рис.

16.6). На карте ген А занимает уча­сток примерно в 2 раза больше, чем ген В. Отдельные точки локуса г IIпроявляют различную мутабильность. Наиболее мутабильные из нихназваны горячими точками. Одна горячая точка в гене В насчитывает500 спонтанных мутаций. В гене А также имеется одна горячая точкаспонтанной мутабильности, насчитывающая около 250 мутаций.При индуцированном мутагенезе в локусе г II распределение го­рячих точек изменяется характерно для каждого использованногомутагена.В экспериментах С.

Бензера была сопоставлена размерность ге­нетической карты бактериофага (частоты рекомбинации) с молеку­лярной размерностью генетического материала, т. е. с числом ну­клеотидных пар молекулы ДНК. При этом за основу были принятыследующие данные. Как показали А. Херши и М. Чейз (см.

Характеристики

Список файлов книги