1625913344-8903f4a71ad640872a209e228a3a0bd4 (531148), страница 27
Текст из файла (страница 27)
Наследственностьисправления ДНК, несущей двунитевые разрывы. Это также механизм рекомбинационной репарации (см. также гл. 8), общая схемакоторого была предложена В. Г. Королевым в 1976 г.У бактерий наряду с постоянно действующими (конститутивными)механизмами репарации существуют и т.
н. адаптивные механизмы,которые начинают работать, когда не справляются конститутивныемеханизмы. Это прежде всего SOS-репарация, открытая Э. Виткин иМ. Радманом в 70-е гг. XX в. Существенным моментом этого механизма репарации является репликация «в обход» повреждения.Системы репарации ДНК клетки оказались весьма разнообразными. Единая картина всего многообразия механизмов репарации всееще находится в стадии уточнения.
В настоящее время механизмырепарации ДНК делят на три группы процессов: фотореактивация,эксцизионная репарация и пострепликативная репарация (рис. 6.3).Последние два типа называют также темновой репарацией.Все пречисленные механизмы репарации характерны как для одноклеточных, так и для многоклеточных организмов. При этом очевидно,что гибель клетки одноклеточных равнозначна гибели всего организма,чего не скажешь о многоклеточных. У метазоа существует дополнительный механизм репарации, устраняющий повреждения ценой запрограммированной гибели отдельных клеток.
Это апоптоз, находящийсяу животных под контролем белка р53. Делеция обеих аллелей гена р53,вызывает ослабление ограничений в контрольных точках на стадиях G1и G2 клеточного цикла, ослабление апоптоза, уменьшение эффективности репарации ДНК и увеличение генетической нестабильности, ослабление контроля за длиной теломер, ингибирование дифференцировки и другие характерные свойства неопластической клетки. Элементыапоптоза находят и у одноклеточных организмов, например у дрожжей.Это лишь показывает, что апоптоз многоклеточных возник в эволюциина базе процессов, которые уже существовали у одноклеточных.6.3. ФотореактивацияЯвление фотореактивации заключается в восстановлении биологической активности клеток или молекул ДНК, поврежденных ультрафиолетовым излучением в результате последующего воздействиявидимого света.При фотореактивации происходит мономеризация циклобутановых димеров тимина и других пиримидиновых димеров in situ.
Известна так называемая неферментативная коротковолновая фотореактивация, которая заключается в мономеризации димеров придействии ультрафиолетового света с длиной волны 240 нм, а также& 141Глава 6. Репарация ДНКАВу^>БУФiУФJПиримидиновыйдимер/I•3'5'-3'-Связываниеферментафотореактивациис димеромI vРепликацияIr i 'W5'3'«rI■5'■3'■5'Рекомбинация■3'5'*•5'.3'■5'УРасщепление 5'—- — 3'димераУ —— — --------- УОсвобождениефермента•3'У-Эксцизия и ресинтез1I5'<3' ---------j--------- 5'♦фотореактивирующий свет■5'3'-ИнцизияI-3'5'-•5'5'«3'-IРесинтез и сшиваниеСшиваниеIУ——5'Интактная ДНКРепарированная ДНКIРепликацияРепликацияJV/Непрерывныедочерние нити ДНКРепликацияРис.
6.3. Схема основных механизмов репарации на примере пострадиационного(УФ) восстановления структуры ДНК (по P. Hanawalt, 1975; Е. Witkin, 1976)А — фотореактивация; Б — эксцизионная репарация; В — пострепликативная репарацияферментативная фотореактивация. Именно последнюю обычно иподразумевают под собственно фотореактивацией.Механизм фотореактивации при действии видимого света (наиболее активная часть спектра — 300-400 нм) был раскрыт в нача142 &Часть 1. Наследственностьле 1960-х годов XX века после выделения К. Рупертом из клетокмикроорганизмов фермента фотореактивации — дезоксирибопиримидинфотолиазы.
Экстракты дрожжей оказались способными восстанавливать трансформирующую активность ДНК Haemophyllusinfluenzae на свету.Субстратом фермента фотореакгивации служат димеры пиримидиновых оснований, с которыми он образует комплекс в темноте(с неповрежденной ДНК фермент не связывается). На свету комплексраспадается, при этом происходит мономеризация димеров. В клетке эукариот фермент локализован в ядре, у прокариот — в непосредственной близости к нуклеоиду. Его не обнаруживают в безнуклеоидных мини-клетках, которые образуют некоторые мутанты Е.
coli.Известен мутант phr Е. coli, у которого блокирована фотореактивация. При облучении видимым светом у этого мутанта не исчезаюттиминовые димеры из ДНК. Фермент фотореактивации широко распространен в природе и обнаружен даже у таких примитивных свободноживущих микроорганизмов, как микоплазмы, найден он в клетках многих высших растений и животных. Он есть у всех изученныхбактерий, за исключением Micrococcus radiodurans, который тем неменее чрезвычайно устойчив к действию ультрафиолетового света: онвыдерживает дозы, в 1000 раз более высокие, чем те, которые убивают Е. coli.
При полном отсутствии способности к фотореактивацииМ. radiodurans обладает мощной системой эксцизионной репарации.6.4. Эксцизионная репарация6.4.1. Эксцизия пиримидиновых димеровЭксцизионную репарацию, связанную с удалением поврежденного участка ДНК, называют также репарацией по типу выщепления-замещения, или, более образно, механизм «режь — латай»(рис.
6.3). Эксцизионная репарация не столь специфична в отношении повреждений ДНК, как фотореактивация, тем не менее наиболее подробно изучена именно репарация ДНК, содержащей пиримидиновые димеры. Этому способствовало то обстоятельство, чтовозможность фотореактивации клеток служит количественным критерием повреждения — присутствия пиримидиновых димеров в ихДНК. Появление димеров приводит к локальной денатурации ДНК,что влечет за собой нарушение репликации: каждый тиминовый димер в ДНК Е.
coli задерживает репликацию на 10 с.Доказательство существования и изучение механизма эксцизионной репарации стало возможным благодаря получению мутантовГлава 6. Репарация ДНК$? 143Е. coli, чувствительных к летальному действию ультрафиолетовогосвета. Если штаммы Е. coli дикого типа, устойчивые к ультрафиолетовому свету, инкубировать в темноте после облучения, то из ихДНК удаляются тиминовые димеры. У мутантов, чувствительных культрафиолетовому свету, этого не происходит.Эксцизионная репарация представляет собой многоэтапный процесс и заключается в: 1) «узнавании» димера, 2) надрезании однойцепи ДНК вблизи димера — инцизии, 3) удалении димера — эксцизии, 4) ресинтезе ДНК и 5) восстановлении непрерывности репарируемой цепи за счет образования ковалентных связей сахарофосфатного скелета молекулы (рис.
6.3).«Узнавание» повреждения в ДНК осуществляет фермент УФэндонуклеаза, который реагирует не только на димеры тимина, нои на многие другие изменения, приводящие к локальному нарушению структуры ДНК. Эндонуклеаза ответственна и за инцизию, т. е.надрезание одной цепи ДНК (разрыв фосфодиэфирных связей) непосредственно около димера с 5’-конца в поврежденной цепи. Эксперименты in vitro с облученной ДНК показали, что число однонитевых разрывов оказывается равным числу димеров в молекуле.Эксцизию, или вырезание димера из молекулы ДНК, осуществляет другая нуклеаза. Димер удаляется в составе короткого олигонуклеотида (3-5 оснований), что может сопровождаться дальнейшейдеградацией поврежденной нити. Продукты деградации облученнойДНК, содержащие пиримидиновые димеры, можно обнаружить вклетках.
У некоторых бактерий димеры находят и в культуральнойсреде. Деградацию ДНК осуществляет АТФ-зависимая ДНКаза.В результате эксцизии и последующей деградации ДНК образуютсяоднонитевые бреши, или пробелы.Ресинтез ДНК, в результате которого заполняются бреши, идетс использованием в качестве матрицы интактной цепи. Такой репаративный синтез ДНК напоминает «дополнительную» репликацию,обнаруженную в пахитене у эукариот. Прямое доказательство репаративного синтеза у бактерий получили Д. Петтиджон и Ф. Хэнеуолт, использовавшие для этой цели метод М. Мезельсона и Ф. Сталя (рис.
6.4).ДНК Е. coli метили 14С, выращивая клетки в присутствии радиоактивного тимина, а затем изучали репликацию в присутствии5-бромурацила, меченного 3Н. В результате нормальной репликации (рис. 6.4, А) при центрифугировании в градиенте плотностиможно наблюдать смещение пика распределения молекул: при этомбромурацил играет роль плотностной метки. В соответствии с этим144 #Часть 1. НаследственностьАРепликацияРепаративныйсинтезФрагментация ДНКпри выделении*IIо_ U(ЛазЗона плотностиобычной ДНК1?£S? °ойоа.
оIнU■е- ®И=г£мк<.'ЯМIIIЗона плотностигибридной ДНКл\:*.:A*v: .VIФракционирование+ОбычнаяДНКГибриднаялНО01ш£оsd(Оо.Номер фракцииРис. 6.4. Схема опыта Д. Петтиджона и Ф. Хэнеуолта, доказывающего существование репаративного синтеза ДНК в клетках Е. coli, облученных ультрафиолетовымсветом (по К. Смиту, Ф. Хэнеуолту, 1972)А — репликативный синтез ДНК; Б — репаративный синтез ДНКГлава 6. Репарация ДНКФ145гибридные молекулы ДНК оказываются меченными ИС и 3Н. Приизучении тем же методом ДНК, выделенной из облученных клеток,обнаруживали только один пик, соответствующий по плотности исходным молекулам. Тем не менее эти молекулы содержали как ИС,так и небольшое количество 3Н (рис.
6.4, Б).Этот пик радиоактивности появлялся вследствие включения5-бромурацила в ДНК в ходе репаративного синтеза. Однако фрагменты ДНК, содержащие 5-бромурацил, столь невелики (в среднемпять нуклеотидов на один димер), что не влияют на плавучую плотность молекул, извлекаемых из клетки. Подтверждением предложенного объяснения наблюдаемой картины служило, во-первых, то, чтофотореактивация снимала ресинтез ДНК: исчезал дополнительныйпик радиоактивности 3Н; во-вторых, репаративный синтез не обнаружен у мутантов, не способных выщеплять пиримидиновые димеры.
Механизм синтеза ДНК, наблюдаемый в ходе репарации послеультрафиолетового облучения, назвали неполуконсервативным.Основной фермент, ответственный за эксцизию димеров и репаративный синтез ДНК у Е. coli, — это ДНК-полимераза I, кодируемая геном polA. Тем не менее у мутантов polA, дефектных по ДНКполимеразе I, все же наблюдается остаточный репаративный синтез,который связан с активностью ДНК-полимеразы II.Известно, что неполуконсервативный синтез ДНК в 99 % случаевпроисходит на коротких участках длиной до 30 нуклеотидов.
За этуреакцию ответственна ДНК-полимераза I. В 1 % случаев синтез идетна гораздо более длинных отрезках — 1000-1500 нуклеотидов. Повидимому, эту реакцию и осуществляет ДНК-полимераза II.Последний этап эксцизионной репарации заключается в восстановлении непрерывности репарируемой цепи ДНК с помощьюфермента ДНК-лигазы, кодируемого геном lig Е. coli. Температурочувствительные мутанты по этому гену не только не способны завершать процесс эксцизионной репарации в непермиссивных условиях, но и накапливают фрагменты Оказаки при репликации ДНК.Различные варианты эксцизионной репарации широко распространены у про- и эукариотических организмов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
