1625913344-8903f4a71ad640872a209e228a3a0bd4 (531148), страница 23
Текст из файла (страница 23)
Корнберга использовали трансформирующую ДНК, то ее трансформирующая активность в результатереакции не возрастала. Оказалось, что ДНК-полимераза, выделенная А. Корнбергом, не является истинной «репликазой». Что же происходит в открытой им реакции?Дело в том, что при выделении из клеток ДНК рвется, так чтообразуются фрагменты с одноцепочечными 5'-концами. При этомкаждый фрагмент с одноцепочечным 5'-концом используется в качестве матрицы для полимеризации комплементарных нуклеотидов,которые связываются с ней водородными связями.
Более короткаяцепь фрагмента, имеющая свободный 3'-конец, служит в качествезатравки, или праймера, к которому ковалентно присоединяютГлава 5. Молекулярные основы наследственности#119ся полимеризуемые нуклеотиды (рис. 5.10). Таким образом,ДНК-полимераза А. Корнбер►-------- ►Н итьоатравкао 'л « |(праймер)О UMга достраивала двуцепочечныеучастки на концах фрагментовРис. 5.10. Схематическое изображениеДНК, после чего реакция остафрагмента ДНК, в котором различаютнавливалась.матричную и затравочную нити (сплошДальнейшие попытки выденые стрелки)лить из клеток бактерий истинПунктир — направление роста цепи ДНК,ную репликазу были связаны ссинтезируемой ДНК-полимеразой I вприменением генетических мереакции А. Корнбергатодов.
Были получены мутанты polA с условным проявлением (в частности, температурочувствительные), лишенные принепермиссивных условиях активности ДНК-полимеразы I, какстали называть фермент А. Корнберга. Эти мутанты сохранялижизнеспособность даже при непермиссивных условиях. Это ещераз подтвердило, что ДНК-полимераза I не является ферментом,реплицирующим ДНК in vivo.Из таких бактериальных мутантов Т. Корнберг (сын) и другие выделили еще два фермента: ДНК-полимеразу II и ДНКполимеразу III.
Эти ферменты также «умели» достраивать двунитевые участки на фрагментах ДНК с однонитевыми 5'-концами.В дальнейшем было показано, что именно ДНК-полимераза IIIучаствует в синтезе полинуклеотидных цепей при репликацииДНК Е. coli. У этого объекта были выделены условно летальныемутанты по гену dnaE, кодирующему ДНК-полимеразу III. Темне менее ни одна из этих трех ДНК-полимераз Е. coli не можетинициировать репликацию ДНК в отсутствие уже готового праймера (затравки).Начало синтеза Д Н К — инициацию репликации— осуществляет иной фермент. Им оказалась РНК-полимераза, кодируемая геномdnaG.
Таким образом, в качестве затравки при репликации бактериальной ДНК ДНК-полимераза III использует полирибонуклеотид,синтезируемый на матрице ДНК. Эти короткие (около 10 звеньев)молекулы РНК в дальнейшем— в ходе роста цепи (элонгации) —удаляет ДНК-полимераза I, которая, кроме полимеразной активностив направлении 5'—»3' растущей цепи, обладает 5'—>3'-экзонуклеазнойактивностью, т. е. способна отщеплять нуклеотиды с 5'-конца. Благодаря объединению этих двух активностей в одной молекуле ферментаДНК-полимераза I удаляет РНК-праймер и одновременно заполняетМатричная нить5* Р120 #Часть 1. Наследственностьобразующуюся однонитевую брешь, полимеризуя дезоксирибонуклеотиды.
Кроме этих двух активностей, ДНК-полимераза I имеет ещеи третью — 3'—>5' экзонуклеазную. Благодаря этой активности ДНКполимераза I осуществляет так называемые корректорские функции,удаляя ошибочно включенные в ДНК основания. 3'—>-5'-экзонуклеазнаяактивность свойственна всем трем ДНК-полимеразам Е. c o li, что обеспечивает высокую точность репликации ДНК.Поскольку все ДНК-полимеразы для синтеза ДНК нуждаются всвободных З'-ОН концах, легко представить себе непрерывную репликацию только одной из двух комплементарных цепей с образованием так называемой ведущей, или лидирующей, цепи ДНК.Что же происходит в «вилке» репликации со второй цепью? Р. Оказаки, используя очень кратковременное (несколько секунд) мечениереплицирующейся ДНК с помощью 3Н-тимидина, показал, что значительная часть вновь синтезированной ДНК представлена короткими мечеными фрагментами — 1000-2000 нуклеотидов.
Эти фрагменты, получившие название фрагментов Оказаки, соответствуюткоротким участкам репликации второй, комплементарной цепи. Наней ДНК также синтезируется в направлении 5'—>3' растущей цепи.Каждый фрагмент Оказаки инициирует короткий полирибонуклеотид (около 10 звеньев), который служит затравкой для дальнейшегороста полидезоксирибонуклеотида (рис.
5.11). После удаления РНКи заполнения бреши с помощью ДНК-полимеразы I фрагменты сое-Рис. 5.11. Синтез ведущей (вверху) и отстающей (внизу) нитей ДНК в вилке репликацииГлава 5. Молекулярные основы наследственности12Рис. 5.12. Электронная микрофотография частично суперспирализованной (А) иполностью релаксированной (Б) ДНК вируса полиомы (I. Vinograd et al., 1965)диняются ковалентно. Эту реакцию выполняет фермент ДНК-лигаза,замыкающая фосфодиэфирные связи.У условно летальных мутантов бактерий, лишенных активности ДНК-лигазы, в непермиссивных условиях ковалентного соединения фрагментов Оказаки не происходит.
Нить ДНК, синтезируемая в виде фрагментов Оказаки, получила название отстающей(lagging).Основные белки, ответственные за репликацию ДНК Е. c o li , перечислены в таблице 5.2.Молекулы ДНК в клетке суперспирализованы (рис. 5.12), т. е.двойная спираль образует витки более высокого порядка — так называемые супервитки.
Необходимая предпосылка репликации — раскручивание суперспирализованной ДНК, разделение и удерживаниекомплементарных цепей в расправленном состоянии, т. е. локальнаяденатурация, или плавление ДНК.Сбрасывание супервитков, или релаксацию молекул, проводятферменты, относящиеся к классу топоизомераз. Особый белок (раскручивающий цепи) осуществляет плавление ДНК. Кроме того, особый класс белков, связывающихся с ДНК, удерживает нити ДНКразделенными. Это так называемые белки, дестабилизирующие122 &Часть 1. НаследственностьТаблица 5.2Основные белки вилки репликации, ответственные за воспроизведение ДНК Е. coli(по Kornberg A. and Baker Т., 1992)ГенАктивностьФункцияDnaADnaAСвязывает ДНК в начале (ориджине) репликации, разделяет двецепи ДНКИнициациярепликацииГеликазаDnaBРаскручивает двойную спиральДНКИнициацияи элонгациярепликацииDnaCDnaCФактор загрузки геликазы, привлекает ДНК-геликазу в ориджинрепликацииИнициациярепликацииПраймазаDnaGСинтезирует РНК-праймерИнициациярепликацииSsbСвязывается с однонитевой ДНК,предотвращая образование «шпилек»; связывается с холоферментом ДНК-полимеразы черезсубъединицу хОблегчает продвижение вилкирепликацииБелокSSBТочная и эффективная репликация хромосомыДНК-полимеразаIII, холофермент1.
Кор ДНКполимеразы III(гетеротример)— субъединица аDnaEДНК-полимераза— субъединица еDnaQ3 ’-5 ’-экзону клеаза— субъединица 0HolEнеизвестна, слабо стимулирует е2. Р-скользящийзажим— субъединица рDnaNФактор процессивности (продвижения)АТФ-зависимый фактор «загрузки» скользящего зажима3. у/т - комплекс— субъединица у/тDnaXАТФаза, организует холофермент— субъединица 8HolAВзаимодействует с Р-скользящимзажимом— субъединица 8’HolBСтимулирует у-АТФазу— субъединица /HolCВзаимодействует с SSB-белками— субъединица уHolDСвязывает %с фактором «загрузки»Синтез ДНК содновременнойкоррекциейошибокОбеспечиваетбыстрый ипроцессивныйсинтез ДНКИспользуяэнергию АТФ,осуществляетзагрузку фактора процессивности на ДНКс уже синтезированнымпраймеромГлава 5.
Молекулярные основы наследственности123Таблица 5.2 (окончание)Основные белки вилки репликации, ответственные за воспроизведение ДНК Е.coli(по Kornberg A. and Baker Т., 1992)БелокГенДНК-полимераза I PolAДНК-лигазаТерминатор репликацииLigATusАктивностьФункцияДНК-полимераза,3'-5'-экзонуклеаза,5'-3'-экзонуклеазаЗамещениеРНК праймеровДНК, созревание фрагментовОказакиЛигазаСшивание однонитевых разрывов, созреваниефрагментовОказакиВзаимодействует с ДНК в сайтетерминации репликацииПрепятствуетпродвижениювилки репликации послезавершения синтеза кольцевойхромосомыдвойную спираль.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
