1625913344-8903f4a71ad640872a209e228a3a0bd4 (531148), страница 22
Текст из файла (страница 22)
Если отделить белок от РНК ВТМ, то РНК практически теряет инфекционность (на99,9%). При реконструкции вирусных частиц (смешивании РНК ибелка ВТМ) они вновь становятся инфекционными. Эти особенности ВТМ и были использованы в опытах. Вирусные частицы были112 #Часть 1. НаследственностьТаблица 5.1Содержание оснований в ДНК из различных источников (по А. Ленинджеру, 1976)ОбъектАGСТКоэффициентнуклеотидной специфичности (A+T/G+C)человек30,919,919,829,41,52овца29,321,421,028,31,36курица28,820,521,529,21,38черепаха29,722,021,327,91,31лосось29,720,820,429,11,43морской еж32,817,717,332,11,58саранча29,320,520,729,31,4127,322,722,827,11,19дрожжи31,318,717,132,91,79Aspergillus niger25,025,125,024,91,00Е. coli24,726,025,723,60,93Staphylococcus aureus30,821,019,029,21,50Clostridium perfringens36,914,012,836,32,70Brucella abortus21,029,028,921,10,72Sarcina lutea13,437,137,112,40,35T726,024,024,026,01,08X21,328,027,222,90,79<pX17424,624,118,532,71,34(pX174(репликативная форма)26,322,322,326,41,18Нуклеотидный состав, %Животные:Растения:зерна пшеницыГрибы:Бактерии:Бактериофаги:реконструированы из РНК стандартного штамма и белка штамма,названного HR.
Штаммы различались аминокислотным составомбелка оболочки. В отличие от штамма HR стандартный штамм несодержал гистидина и метионина.Вирусные частицы-потомки, образовавшиеся в результате инфекции растений, по аминокислотному составу белка оболочки и другимГлава 5. Молекулярные основы наследственностиЗ н о и ец1133'-кон«иРис. 5.5. Полинуклеотидные цепи ДНК (А) и РНК (Б)признакам всегда соответствовали тому штамму ВТМ, от которогобрали РНК.
Таким образом была показана роль РНК как носителягенетической информации у ВТМ.Итак, свойство наследственности оказалось связанным с нуклеиновыми кислотами, и прежде всего с ДНК.5.2. Полуконсервативная репликация ДНКМодель структуры ДНК, предложенная в 1953 г. Дж. Уотсоном иФ. Криком, объяснила кодирование генетической информации, мутационную изменчивость и воспроизведение генов (см. гл. 1), которые, согласно этим представлениям суть участки молекулы ДНК.В 1957 г. М. Мезельсон и Ф.
Сталь подтвердили представленияДж. Уотсона и Ф. Крика о полуконсервативном механизме воспроизведения {репликации ) ДНК в клетках бактерий (рис. 5.6).Г. Стент предложил рассматривать три потенциально возможныхспособа репликации ДНК (рис. 5.7): 1) консервативный, при котором новые молекулы не содержат материала родительской ДНК;2) полуконсервативный, при котором новая молекула представленаодной родительской и одной вновь синтезированной цепями; 3) дисперсный, когда материал исходной молекулы случайно распределенв обеих цепях дочерних молекул. Эксперимент М. Мезельсона иФ.
Сталя позволил сделать выбор между этими тремя вариантами(рис. 5.8).114 #Часть 1. НаследственностьРис. 5.6. Схема полуконсервативной репликации ДНК (Г. Стент, 1974)Главный вопрос— как различать исходные молекулы ДНК имолекулы-потомки — был решен благодаря привлечению из ядерной физики нового в то время для биологии метода — равновесногоцентрифугирования в градиенте плотности CsC 1. При этом для мечения вновь синтезируемых молекул была использована утяжеляющая (плотностная) метка — изотоп азота l5N.Для этой цели клетки бактерии Е. coli в течение нескольких делений выращивали на среде с единственным источником азота —15NH4C1, так что вся ДНК оказывалась равномерно помеченной l5Nи имела плотность 1,724 г/см3 в отличие от плотности обычной ДНК(1,710 г/см3), содержащей только 14N.
Такие образцы тяжелой и легкой ДНК можно разделить, если их смесь ультрацентрифугировать вградиенте плотности CsCl. При помещении 6М раствора CsCl в центрифужные пробирки и при ускорении 105 g в течение 20 ч создаетсяГлава 5. Молекулярные основы наследственности&115ВРодительскаяРодительская' РодительскаяГ; 'с; SV>Vb СЧ5 У £ ht; § § §Рис. 5.7. Три возможных варианта воспроизведения ДНК (А - консервативный;Б - полуконсервативный; В - дисперсный) между которыми был сделан выбор вэксперименте М.
Мезельсона и Ф. Сталя (по А. Ленинджеру, 1976)Направление седиментацииРодительская ДНК(обе цепи тяжелые)IДНК с двумялегкими цепямиЛегкаяДНКтI[сСмесьтяжелойи легкойДНКСмесь тяжелойи легкой ДНКДНКиз клетокIОдна репликацияпоколенияДНКиз клетокIIДве репликациипоколенияДНКиз клетокIIIIпоколеният4vvТрирепликацииРис. 5.8.
Схема эксперимента М. Мезельсона и Ф. Сталя, доказавшего полуконсервативный механизм репликации ДНК (по А. Ленинджеру, 1976)116 &Часть 1. Наследственностьградиент плотности раствора. Каждый тип молекул седиментируетдо тех пор, пока не достигнет зоны своей плотности.М. Мезельсон и Ф. Сталь в своих экспериментах использовали аналитическую ультрацентрифугу, в которой фиксировали распределениеДНК в градиенте при помощи ультрафиолетового света с длиной волны 260 нм, которую поглощают нуклеиновые кислоты.
Смесь тяжелой(15N) и легкой (,4N) ДНК давала две зоны поглощения УФ-света.Если бактерии, выращенные на среде с l5N, переносили на средус 14N и давали им делиться только один раз, то ДНК, полученнаяиз них, собиралась только в одной зоне, поглощающей УФ-свет. Положение вновь синтезированных молекул оказывалось промежуточным — между тяжелой и легкой ДНК. Этот результат исключаетконсервативный механизм репликации.Если бактериям давали делиться на обычной среде дважды, то появлялся пик легкой ДНК и сохранялся пик ДНК промежуточной плотности, не исчезавший и при последующих делениях. Этот результатпротиворечит дисперсному механизму репликации. Таким образом,именно полуконсервативный механизм лежит в основе репликацииДНК.
В соответствии с этим механизмом ДНК, появляющаяся послепервого деления клеток на обычной среде и занимающая промежуточное положение в градиенте плотности, должна представлять собойфракцию «гибридных» молекул. Тогда одна нить (старая) должна содержать только 15N, а другая (новая) — только 14N. Чтобы в этом убедиться, нужно суметь разделить «старую» и «новую» нити.
Сделатьэто сравнительно просто: нужно нагреть ДНК до 100 °С.При этом разрываются водородные связи между основаниями,но сохраняются все ковалентные связи. Происходит так называемоеплавление, или денатурация, ДНК.Как показали М. Мезельсон и Ф. Сталь, если выделить ДНК промежуточной плотности и расплавить ее, т. е. прогреть в течение30 мин при 100 °С, быстро охладить и вновь центрифугировать вградиенте плотности, то обнаружатся два пика, один из которых поплотности соответствует денатурированной легкой (l4N), а другой —денатурированной тяжелой (I5N) ДНК.Полуконсервативный механизм репликации ДНК, доказанныйМ.
Мезельсоном и Ф. Сталем, оказался столь же универсальным длявоспроизведения генетического материала, как и сама структура ДНК.Более того, в тех сравнительно редких случаях, когда генетический материал представлен однонитевой ДНК, как, например, у бактериофага фХ-174 и некоторых других, при их воспроизведении вклетке синтезируется так называемая репликативная (двунитевая)Глава 5. Молекулярные основы наследственностиIII117IVРис. 5.9. Схема распределения меченного 3Н тимидина при удвоении хромосомViciafaba (по Дж. Тэйлору, 1963)Пунктирная линия изображает меченую субъединицу хромосомы, сплошная — немеченую.Точки — зерна засвеченной фотоэмульсии на радиоавтографе.
I — удвоение вприсутствии 3Н-тимидина; II — первая метафаза после включения метки; III — удвоение в отсутствие 3Н-тимидина; IV — вторая метафаза после включения меткиформа (РФ). Эта РФ далее реплицируется на основе полуконсервативного механизма.Доказательство полуконсервативного механизма репликацииДНК послужило и первым прямым доказательством справедливостимодели Дж. Уотсона и Ф. Крика.Полуконсервативный механизм репликации показан также длямитотических хромосом высших животных и растений, в частностидля хромосом бобов — Vicia faba.
Дж. Тэйлор помещал проросткиV.faba в среду, содержащую тимидин, меченный тритием, на время одного (или части) клеточного цикла. Это приводило к тому, чтохромосомы оказывались равномерно меченными 3Н, что фиксируется авторадиографически. Затем проростки переносили в среду безрадиоактивной метки, но содержащую колхицин. Последний применяли для того, чтобы дочерние хроматиды не расходились, а оставались в одной клетке (см. гл. 4).Во время первой метафазы в «холодной» (без 3Н) среде мечеными оказывались обе дочерние хроматиды, а в следующем делении вметафазе одна хроматида оказывалась меченой, а другая немеченой.Эти результаты свидетельствуют о полуконсервативном воспроизведении ДНК хромосом (см.
рис. 5.9) и совместимы с представлениемо том, что митотическая хромосома содержит одну двунитевую молекулу ДНК.118 &Часть 1. Наследственность5.3. Энзимология репликацииМодель Уотсона-Крика дает общее молекулярное описаниеструктуры и функции генов, предполагает принцип репликации генетического материала. Доказательство полуконсервативного механизма репликации ДНК заставило по-новому взглянуть на основныехарактеристики двойной спирали Уотсона-Крика.Для того чтобы понять, как работает полуконсервативный механизм репликации, необходимо ответить на ряд вопросов: как разделяются комплементарные нити ДНК, закрученные одна вокруг другой? Какая ферментативная система воспроизводит ДНК с учетомантипараллельности ее цепей? И другие.Первый обнадеживающий результат на пути к пониманию ферментативного механизма репликации ДНК был получен А.
Корнбергом (отцом) в 1956 г., когда он выделил из клеток бактерии Е. coliфермент ДНК-полимеразу. Этот фермент осуществлял синтез ДНКпри наличии в реакционной смеси всех четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов: АТФ, ГТФ, ЦТФ, ТТФ и молекул ДНК:пдАТФпдГТФДНК-полимеразапдЦТФ + Д н к ----------------------пдТТФдАМФдГМФдЦМФ+ Д Н К + 4пФФн.LaTM®В этой реакции количество ДНК увеличивалось в 20 раз по сравнению с внесенным изначально. По своему нуклеотидному составувновь синтезированная ДНК была неотличима от исходной. Реакцияполностью зависела от присутствия всех четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов. Казалось бы, осуществлена репликация ДНК invitro. Однако если в реакции А.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
