Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.3 (522944), страница 67
Текст из файла (страница 67)
ТЫз геаггап8еисепс георепз сЬе ргипагу Ьус)гоху1 оп С3 со а зесопс1 сус1е ос асесу!асюп йас 81чез гье со сЬе с!)асесу1асес) ргоссисс 1,3-йасесу1 сЫогагпрЬепко!. ТЬе САТ депе ь гезрогсяЫе 1ог геязсапсе со сЫогашрЬешсо1 ш зсга)пз ог" Ьассепа йас аге геязсапс со 11се апссЬюнс.
Агсег спопо- ог с))асс!у!а!!оп, сЫогапсрЬешсо1 саппос Ь)пс) со сЬе рерсЫу! сгапзгегазе сепсег ог" рго)сагуоск пЬозошез, сЬе ехс1ияче саг8ес сог йе апЕЬсонс'з ассюп. 1п Ее!г) зсгашз ос ЕисегоЪассепа апг) осЬег Сгапс-пе8асгче Ьассепа, сЬе САТ 8епе Ь сопзйинче!у ехргеззес! апс) Ь изиаПу сагпес1 оп р1аяпссЬ сЬас соссгег пш!сср!е с)ги8 геязсапсе. 1п зсарЬу!ососсс, САТ асьпсу ь а!спозс шчапаЫу епсог)ес! Ьу япа11 (<5 !сЬ) р)аяпЫз сЬас саггу по осЬег гезЬсапсе шаг)сегз.
Аиипо асЫ зес)иепсез ос зечега! чапапсз ос САТ сгош ЬосЬ С гаги-рояле апс) Сгапс-пе8аИче Ьассепа аге Ы8Ыу Ьошо)о8оиз. А)! )сиосчи чапапь аге спспеь сопязЕп8 ос Ыепска! зиЬишь ог ЛХ, = 23 000. Т!се суре 1 чапапс, счЬкЬ ь епсоссес) Ьу а ! 102-Ър зе8шепс ос' сгаизрозоп Тпр, Ь ги гчЫе изе аз а герогсег 8еие. Ноъчечег, пгозс )пиес!с апс) зсгиссига! апа1узез аге саспенс оис иисЬ йе суре Ш чапапс, счЬ)сЬ у!е!дз сгузса1з зшсаЫе сог Х-гау апа1уяз.
ТЬе спгпепс зсгиссше ь зсаЬ11)хес) Ьу а 8-р!еасес! зЬеес сЬас ехсепсЬ сгош опе зиЬипЬ со сЬе пехс (Еез!!е ес а1. 1988). ТЬе пчо зиЪзсгасез )сЫогашрЬепссо1 апс) асесу1-СоА) арргоасЬ йе арче ясе сЬгои8Ь сиппе1з !осасес) оп орроясе яс)ез оссЬе пю1еси!е. ТЬе аснче ясе, счЬ1сЬ Ь 1осасесс ас йе ягЪшис 1исегуасе, сопсаспз а Ь!зссйпе геяс!ие, кЬкЬ Ь розси!асес) со асс аз а Еепега! Ьазе сага!узс ш йе асесу!акоп геассюп (Еез!)е ес а1.
1988; 3Ьасч ес а1. 1988). снс1, ,Ф Озй ' ' С вЂ” С вЂ” Снзсн ОН Н псе!у!-СоА оЫогашрПеи!оо! асегуИгаиз1егазе снс1, -Сн Озн Сз Сз=с ОН Н СНз 3-асесу! сЫогигпрПеп!оо! Е1СЕ)КЕ 17-14 Кеасноп Сага) хес! Ь САТ !п)отта!(оп Раве!т 17.95 Ехргехх!оп оЕ САТ !п А4агпгпа!!ап Се!!5 'тт(гтиаПу аП става(естюп ехрегппепта тч(тЬ САТ Ьаче Ьееп сагпед ои| чд|Ь сова!госта депчед Егогп |Ье р! ахгп|д р5Ч2САТ, |чЬ|сЬ сопсаша |Ье 5Ъ40 ртоп|о|ебепЬапсег, 29 Ьр оЕ ив!тапа! атед тес)иепсе, йе САТ- сод(п8 тес)иепсе, апд 8 Ьр оГ РЫЛ 3' |о |Ье ()АЛ асор содоп (Соппап 1985). р5'тт2САТ саппо| соп(ег сЫогагпрЬешсо) геяатапсе ироп Ьас|епа Ьесаиае йе САТ Пепе Ь пос!ш)сед |о а рго)сагуо6с ргопю|ег.
То аяау ри|апче ргогпотега ш тпатп|па1|ап сеПВ а с(епча|в е оГ р5Ч2САТ Ьаа Ьееп сопяп|с|ед (р5'тгОСАТ) (богшап е| а!. 1982) йас аПотча йе ргошо|ег ге8(оп оГ 5Н40 |о Ье гер!асед Ьу |Ье ргогпо|ег ипс1ег сеат. ТЬе САТ депе ГиИ!а гпапу оЕ |Ье сп|епа тес(и(гед оГ ап Ыеа! геропег Вепе ш п|агшпаПап сеПя Веса|ье САТ ь а рго1|агуобс епхуп|е, йеге аге по епс(о8епоы от сошрет(п8 ас|п66ез |и п|апипа1 |ап сеП| авд йе епхугпе Ь т!ш|е атаЫе.
Нотчечег, аогпе оЕ тЬе апауа иаед |о шеааиге САТ ас6чПу |и!ухасеа оГ |гапя Еес|ед сеП| аге ехрепяче апд Яше-сопашпш8, апд ип1ем Вгеа| саге Ь са(сеп, йеу п|ау Ье |пассига|е. Мапу оГ Йе о1дег апаух аге чапа|юпа оп йе шетЬода оЕ 5Ьатч (1975) апд Соппап е| а1. (1982) ш |чЫсЬ ех|гась ргерагед Егош !тапа(естед сеП| аге |псиЪасед чд|Ь '|С-1аЬе!ес1 сЫогап|рЬеп(со!. ТЬе асс|у!а|ед ргос)ись аге аерагатед (топ| |Ье ип|посПЯе|1 с)ги8 Ьу |Ып-)ауег сЬгоп|а|о8гарЬу ап|1 с)иап|па|ед Ьу аи|огасПо8гарЬу ог Ъу асгар)п8 |Ье ароса Яо|п йе |Ып-1ауег р!асеа ап|1 соипбп8 6|еп| Ьу |сшЯПа|юп трет!го|сору.
САТ асбчиу Ь тЬеп са!си)а|ед ах йе регсеп|а8е оГ сЫогашрЬепко! сопчепед |о пюпо- апд сПасе|у! а|ед ргодис|я Но|течет, аП оЕ тЬеае о!дег гпетЬода аге!аЬог-ш|епяче, ъеппс!иапйа6че, апд оГ Ппп|ед аепя||ч||у (-10 | ип(та оЕ САТ ас6ч1|у). (Опе ш|егпа|юпа! оп|| оЕ САТ ь дейпед аа йе атпоипс оГ епхутпе |Ьа| сага!)иеа |Ье ргодис|юп оЕ ! |ипо1е оЕ ргос!ис| рег пипи|е. ТЬ1| 1| арргохппа|е1у е|1шча1еп| |о 1.5 х 10' ' п|о1- еси)еа оГ епхуше.) ТЬе шаепя6чву оГ йе апау (а |и ракс дие со йе ргеаепсе оГ епгугпеа ш ех|гась оЕ !тапа(естед сеПа |Ьас Ьудго1ухе асе|у1-СоА.
ТЬе аепя|пд|у апд гергодис(Ь~16у оЕ |Ье апау аге 8геаду ипргочед |Г йе ехтгаста аге ад)и|сед |о 10 |пМ ЕРТА апд |Ьеп Ьеа|ед |о 60 С Гог 10 пипитеа (51е|8Ь 1986; СгаЬЬ апд Р(хоп 1987) ЬеЕоге аааау, !четчег аяауа йа| спси|пчеп| йе иае о! |Ып-1ауег сЬгоп|а|о8гарЬу шс1иде йе асе|у1а|юп оЕ ип!аЬе!ед сЫогап|рЬепко) |чвЬ '4С!аЬе1е|1 асесу1-СоА. А| йе епд оГ йе геасбоп, |Ье пихшге Ь ех|гас|ед тч)ГЬ ейу! асеса|е, ТЬе п|ово- ав|1 сПасе|у!а|ед Еогша оГ сЫога|прЬепко1 раг6|и|п ш|о |Ье ог8ап|с рЬаае, |чЬегеах йе асе|у1-СоА геша!па ш йе ас)иеоиа рЬаае.
ТЬе ап|оип| оЕ сЫогашрЬепко! сопчег|ед |о йе асе|у!а|ед Еопп сап |Ьеп Ье шеааигед |и а 1и)и)д |с|п6Па6оп соипсег. 5иЬ|ет(иепс чапа- тюпа оп ЙЬ аьау шс1ш1е: ° Ех|гас|юп оГ геас|юп ргодиста што 1щи(д асшгП1а|юп Яиог (е.8., р1еаае аее Еаатшап 1987; 24еишапп е| а!. 1987; ЬПе!аеп е| а1. 1989).
° Епгушат(с Ъи|уга|юп о(' гасПо!аЪе!ед сЫогашрЬешсо! (5еед апд 5Ьееп 1988). ° Рте оЕ Яиогеасепс |иЬ||га|еа Еог САТ |Ьа| йар1ау Ьп8Ы Яиогеасепсе |чЬеп ехсПе|1 а| йе арргорпа|е |чаче1еп8Й ( тоип8 е| а!. 199 Ц, Веса|ье оГ йе реси1|аг сЬеш)атгу оЕ йе СЛТ геас6оп, Ьо|чечег, попе оГ тЬеае апауа аге |ги1у т)иап6- |апче. Аа с1Ьсиме|1 аЬоче, |Ье |попоасесу!атее! геасиоп ргос1ис|, 3-асс|у! сЫогашрЬешсо1, ь сопчепес1 Ьу а попепхуша6с геашап8е|пеп| |о 1-асе|у1 сЫогап|рЬешсо!.
ТЬ)а гегпаша т(8Ьт)у Ьоип|1 |о САТ апд ы йеп асе|у!а|с|1 ге1а6че!у |1о|ч!у со 1,3кПасесу1 сЫога|прЬешсо!. Лхаауа |Ьа| шеааиге |Ье у|е!д оГ п|опо- апдтог сПасе|у!а|ед ргодисыЬеге(оте саппо| Ье т(иапт(та6че. ТЬЬ ргоЫев| ь ехасегЬа|ед |чЬеп Йе сопсеп|га6оп оГ |иЪ|па|е ш |Ье аяау Ь я8шйсап|!у 1о|чег |Ьап |Ье К„, оЕ САТ Еог сЫога|прЬешсо1, тчЫсЬ (х чапо|ь1у герот|ед |о Ье Ьепчееп 75 апд 60 !|м (е.8., р!еаае аее 5ап(|агап 1992 апд геЕегепсеа Йегеш). САТ аыауа сап, Ьотчечег, Ье шаде |п|1у с!иап|пабче Ьу ||чо шейодя ° (3зе аа |иЬа|га|е 1-с(соху сЫогашрЬешсо! (Миггау ес а1, 991). ТЬЬ сшЬ||га|е, ш тчЬзсЬ |Ье гея|Ьте оп |Ье С1 а|оп| Ь гер!асед Ьу а рго|оп, 8епегасеа а яп81е асе|у1а|ед ргодис| (З-асе|у1, 1-деоху сЫогап|- рЬеп|со1), |ЬегеЬу яшрПГуш8 гпеааигеп|епс оЕ спту|папе асдчПу.
ра|Поас||че 1-деоху сЫогап|рЬешсо! Ь а| адаЫе Ггош Ашегйатп. ° Меаяше |Ье шв(а! )дпебса оГ Йе епхуп|абс теас6оп, |пх|еад оГ Йе гасПоас|пд|у ассипш! а|ед айег а ает )еп8|Ь оГ |ппе. ТЬЬ тчП1 епхиге |Ьа| |Ье геасбоп Ьах по| Ьееп регЕогшед ипс(ег сопсП6опа |чЬеге аиЬ- а|гаге ь 1нпшп8 (13е|Ьоп е| а1. 1992). 1| Ь ргеГегаЫе |о ехргеп СЛТ ас6чПу аа |Ье ап|оип| оГ ргодис| Гот|пед рег п|П!|8гаш сеП ех|гас| рег ипП пгпе (Е.е., аа а арес|Т|с ас||чПу, по| ягпр1у ах а регсеп| сопчегаюп 68иге).
)7.96 СЬартет 17: Апа!уы оубеие Ехртеыюп |и Си1титетЕ Маттайап Се!6 И)С!ГЕ!4АЬЕ 1| ь !ис)Еегаае ас6чпу сЬас ша)теа 6геццеа ц!о|ч аа йеу с)апсе |ЬгоицЬ йе аиспшег шцЫ ак. Ъйп!е ргочЫ- шц сЫ!|1|еп сч)сЬ соипс1ея Ьоша оЕ сииПВЬс Еип, !ис!Еегаае а1ао а)тЬ тпо)еси!аг Ыо!оц)аса шсегеасес) )п п|апипацап цепе сгапаег)рсюп. |С|1|Ь Ее|ч ехсерсюпя сшеЬ аа йе цис оЕ йе 6гебу Ьеес)е апт) аоп|е шаппе огцапВпь, 1ис!Еегаае ептуше асс!ч)су В пос Еоип|1 ш еи1|атуоПс сеця ап|1 сЬ|ь П аегчеа ах ап ехсецепс теро|тес цепе ш ргопюсег апа1уяа асийеа.
Моас!ие!Еегаае спас)тег цепеа сиггепс1у |и иае Еог рготпосег апа!уа!а аге тсеттчет) Еготп сЬе !ис репе оЕ |Ье 6гебу 1РЬотпшт рута!|Т) Ет)е Сатес ес а1. 1985, 1987; Вгопасе!и ес а1. 1994). ТЬе и616у оЕ сЬе 6гейу !ис!Еегаае цепе ччаа гесоцп!тед Ьу с)е Ъ)тес ес а1. 11987) |чЬо Во1асе|1 П|е цепе апт! ехргеаает) 1с аа ап а<6че ептуше )п гпатп|пацап сеца. ТЬеае аисЬога соо)т ат)часссаце оЕ спапу уеаь оЕ геаеагсЬ офпсо йе ЫосЬеш)ассу оЕ еЬепп!иш!пеасепсе апс) Ью1ипнпеасепсе со т)ече1ор а тарЫ апт) аепяПче аяау Еог 1ис!Еетаае ае6ч|су ехргетьет) Егоп| сгапаЕессет) Р)4Аа.
гцпсе сЫа |п|с|а1 теро|с, |папу пют66- са6опа Ьаче Ьееп шаг)е со сЬе 1ис!Еегаае а|ьау |пс1иеПпц сЬе с)ече1орпсепс оЕ спойЕ|ет) !ис!Еегаае цепеа |чПЬ ЫВЬег 1ече1а оЕ ехргеяюп, сЬе иае оЕ тцйечепс аяау геацепь йас сЬапце йе Ыпе6еа оЕ ПцЫ ге1еаае, |Ье сье оЕ япаП гпо1еси!еа сЬас асаЬ~1|хе сЬе 1ис!Еегаае епауше, ап|1 йе ьо!а6оп ап|1 ехргея!оп оЕ 1ис!Еегаае цепеа Егоп| аечета) сПЕЕегепс огцап)ыпа 1|)е Схтес ес а1. 1987; Вгопасеш ес а1. 1994; Н)шеа апт) Я|аппоп 2000). ТЬе ептуше Ьаа а сЬагассепацс ЬеЬатцог ч6|Ь геареес со аиЬасгасе арес|6сПу, 68Ьс ге1еаае ЫпеПся ацоасепе тпос)и1аиоп, ап|1 шсгаееци1аг яаЬППу, Ьис|Еетаае, ш сЬе ргеаепсе оЕ Мцт', сиса!утеа сЬе теас6оп: АТР + 1ис!Еегш + О, — | АМР т оху1ис)Еет)п 4 РР т ПВЬ| Е5Е|0 пгп) ТЬе 1ие)Еегаае епхуше епсодес) Ьу сЬе 6гебу сРНА сои|а)па а рерс|це ает)иепсе ас Па сагЬоху! сегп~псь |Ьас сагцеь сЬе ргосе|п со |Ье регохьоп|е сотпрагсгпепс оЕ |Ье сеП. ТЬе ретохВоп|е В а |шЬсеПи1аг отцапеце аиггоипс)ет) Ьу а Пр|6 Ь~1ауег сЬас сопсаша а чапе|у оЕ ептушеа рагск)раПпц |и ох|цас|че п|есаЬ- о16п| апт) осЬег аарееь оЕ шсегтпеецагу тпесаЬоцаш.
Еаг1у асиецеа аЬосчет) йас очегехргеяяоп оЕ 1ис|Еегаае Егоп| юше ргоспосет сопягись очес)оат)етт сЬе сараеиу оЕ йе регох|аоп|е со ппрогс сЬе ептуше,!еатцпц со а сопа6расед ап|1 яс)с сеП. То е!игппасе сЬ!а апс) осЬег ргоЫепь ге1асшц со сЬе ехрге|ьюп оЕ ап шаесс епхуспе ш п|апппацап сеП Ппея ъечета! а!сегацопа Ьаче Ьееп п|ат)е со йе ог!ц!па! 6гебу 1ие)Еегаае сус!4А, !пс1итПпц тЬе гегпоча1 оЕ сЬе регохьо|па1 сагцесшц ает)иепсе, йе ецпипасюп оЕ аеПиепсев ргейссед со ц!че Нее со ПЕ4А аесопт)агу асплссше, |Ье шс1ияоп оЕ ап орс|пштп |тапа)а6опа! |ш6а6оп ает)иепее 1а Коха)с аес)иепсе), йе ячарр|пц оЕ ргеча1епс !паесс сот!опт Еог сЬе|г тпагпп|ацап соипсеграгся сЬе |пс1|ьюп оЕ ро!уас)епу1асюп ает)иепсеа ирастеаш апт) т)осчпасгеапс Еготп |Ье!исйегаае е)914А, апс) |Ье гепюча1 оЕгеаст)сПоп епхуше ясеа ъч)сЫп йе с)9)4А.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
