Диссертация (1174327), страница 11
Текст из файла (страница 11)
В тоже61время экспрессия miR-124-3p изменяется через 24 часа только в ткани мозга, а через48 часов – и в ткани мозга, и в лейкоцитах.Таблица 3. Изменения в уровнях экспрессии мкРНК в ткани левого полушариямозга и лейкоцитах крови через 24 и 48 часов после ишемического воздействияТканьТканьр,р,р,мозга,Лейкоцимозга,Лейкоцир,мкРНККИты,КИКИты,КИUUUU-test(0/24 test (0/24 ч)(0/48(0/48 ч)testtestч)ч)let-7f-5p2,3770,02 1,724н/о*3,8620,004 6,424н/оmiR-21-5p3,1850,01 1,664н/о6,7040,002 6,488н/оmiR-223-3p 2,641н/о1,995н/о10,20,020 2,813н/оmiR-30a-3p 1,299н/о1,683н/о6,060,004 3,480н/оmiR-30c-5p 1,137н/о1,861н/о2,7560,020 3,846н/оmiR-99a-5p 1,393н/о1,722н/о2,3420,008 2,042н/оmiR-107-3p 1,056н/о1,822н/о1,6670,004 1,653н/оmiR-221-3p 1,274н/о2,182н/о2,0620,002 7,823н/оlet-7i-3p1,376н/о1,181н/о1,860,008 2,373н/оmiR-212-3p 1,093н/о1,367н/о1,9380,010 2,274н/оmiR-497-5p 1,006н/о1,7680,031,7030,008 0,896н/оmiR-124-3p 1,517н/о1,099н/о1,7520,008 9,006н/оmiR-23a-3p 1,261н/о1,307н/о2,6860,020 2,934н/оmiR-22-5p1,224н/о1,652н/о2,120,015 2,136н/оmiR-99a-5p 1,393н/о1,722н/о2,3420,008 2,042н/оПримечание - статистически незначимые отличия (н/о) при p > 0.05; U-test.Корреляционный анализ между значениями экспрессии мкРНК в мозге и вкрови крыс показал достоверную корреляцию для miR-200b-3p, miR-23a-3p, miR99a-5p, miR-22-5p и miR-330-5p (Таблица 4).62Таблица 4.
Корреляция уровней экспрессии мкРНК в ткани мозга и лейкоцитахкрови через 24 часа и 48 часов после ишемического воздействия.мкРНК24 часа, p24 часа, ρ,48 часов, p48 часов, ρ,miR-200b-3p0,0480,85н/о0,02miR-22-5p0,016-0,94н/о-0,2miR-23a-3pн/о0,430,0330,89miR-330-5pн/о-0,490,033-0,89miR-99a-5pн/о-0,540,0330,89В данной работе были исследованы не только «ведущие» цепочки зрелыхмкРНК, но и некоторые «пассажирские». Так экспрессия обоих цепочек былапроанализирована для следующих мкРНК: let-7i, miR-22, miR-27a, miR-29a,miR-29c, miR-30a, miR-99a.
В ткани мозае всех крыс экспрессии miR-22, miR-29a иmiR-29c прямо коррелировали между «ведущей» и «пассажирской» цепочкой(Таблица 5). При этом достоверная корреляция у miR-22 и miR-29a присутствовалатолько у ишемизированных животных, тогда как у ложнооперированных онаотсутствовала, более того, по значению корреляции по Спирмену она былаобратной. В лейкоцитах переферической крови животных достоверная корреляциябыла только у let-7i после ишемии (p = 0,045 и ρ = 0,738), а также тенденция кдостоверности у miR-27a (p = 0,057 и ρ = 0,714) перед ишемией.63Таблица 5. Корреляция уровней экспрессии «ведущих» и «пассажирских»мкРНК в ткани мозга ишемизированных крыс через 24 и 48 часов послеишемического воздействия, а также у группы контроляВсеВсемкРНКИЖ, pИЖ, ρ ЛОЖ, p ЛОЖ, ρживотные, p животные, ρlet-7i0,934-0,0250,8030,1430,3320,222miR-220,0360,5500,297-0,5430,0020,642miR-27a0,532-0,1750,1750,6570,4950,157miR-29a0,0030,7210,419-0,429<0,0010,803miR-29c0,0560,5070,0580,8290,0080,566miR-30a0,3820,2430,9190,0860,2240,277miR-99a0,1570,3860,919-0,0860,0940,375Примечание–ИЖ–ишемизированныеживотные,ЛОЖ–ложнооперированные животные.3.3 Дифференциальная экспрессия мРНК в ткани головного мозга крыс,подвергшихся фотохимически индуцированного тромбозуСтабильность генов эндогенного контроля определяли также, как и в случаес мкРНК.
По результам теста наиболее стабильным оказался ген ACTB. Кроме того,в ряде руководств и статей указано, что ген GAPDH может изменять своюэкспрессию под действием гипоксии [161], поэтому было решено нормироватьэкспрессию мРНК только на ACTB.Нами было обнаружено, что экспрессия гена NEUROD1 статистическизначимо уменьшается через 24 часа после ишемического повреждения в левомполушарии экспериментальной выборки крыс по сравнению с контрольнойвыборкой (Рисунок 10).64****Рисунок 10.
Уровни нормированной на ACTB экспрессии NEUROD1,выделенного из коры левого полушария ишемизированных крыс через 24 часа(24ч) и 48 часов (48ч), а также у ложнооперироанных животных. Данныепредставлены в виде медианы и квартилей. Точкой обозначены выбросы –значения, которые больше 3го квартиля или меньше 1го на 1,5хИКР; где ИКР –расстояние между 1м и 3м квартилем.
* - p < 0,05 ** - p < 0,01, для несвязаннаыхвыборок по U критерию Манна-Уитни.Через 48 часов после фотохимически индуцированного тромбоза экспрессия13 генов статистически значимо уменьшилась (Таблица 6).В тоже время, было отмечено, что экспрессия большинства генов через 48часов после ишемии не изменяется или незначительно уменьшается. Так среди 6мРНК, экспрессия которых статистически значимо изменилась через 48 часов посравнению с 24 часовой точкой только ген, кодирующий транскрипционныйфактор NeuroD1 был гиперэкспрессирован. Остальные гены (FOS, BCL2L2, TNF,ATOH1 и MECP2) были гипоэкспрессированы.
При этом экспрессия генов ATOH1и TNF была незначительно повышена в биоптате мозга крыс через 24 часа послеишемии по сравнению с контрольной выборкой.65Таблица 6. Дифференциально экспрессирующиеся мРНК в ткани левогоишемизированного полушария головного мозга крыс через 48 часов послеишемического воздействия.мРНКр, U-testКИмРНКр, U-testКИBCL2L20,0010,27HES50,0200,38NEUROG30,0010,30NEUROG10,0200,32NEUROG20,0030,50ATOH10,0290,28NFKB20,0080,41HIC10,0290,63FOS0,0130,34NOTCH30,0290,60NEUROD10,0130,70CREB10,0430,83TNF0,0130,59Сравнительный анализ экспрессии мРНК в ткани правого полушарияголовного мозга крыс показал, что в группах экспериментальных животных через24 и 48 часов после фотохимически индуцированного тромбоза уровни экспрессии42 из 51 исследованных мРНК различаются более чем в 1,5 раза.
Среди них, вобразцах, взятых через 24 часа после ишемии, идентифицировано 31 мРНК,экспрессия которых изменялась в пределах 1,5–4,4 раз по сравнению сложнооперированными животными. При этом достоверные отличия в уровняхэкспрессии были у 11 генов: ATOH1 (КИ = 4,36), BAD (КИ = 1,57), BCL2L11 (КИ =2,51), CASP9 (КИ = 1,91), HES5 (КИ = 2,54), IKBKB (КИ = 1,48), MECP2 (КИ = 2,17),NEUROD1 (КИ = 1,92), NEUROD4 (КИ = 1,92), NEUROD6 (КИ = 1,38), SOX2 (КИ =2,19).В образцах, взятых через 48 часов после фотохимически индуцированноготромбоза наблюдается больше статистически значимых дифференциальноэкспрессирующихся генов – 21 (p < 0,05; U-test) (Таблица 7)В тоже время экспрессия только трех генов (FAS, HES1, PPARGC1A)статистически значимо отличалась между образцам мозга крыс, взятыми через 48и 24 часа после ишемического повредения (Рисунок 11).66Таблица 7.
Дифференциально экспрессирующиеся мРНК в ткани правого«интактного» полушария головного мозга крыс через 48 часов послеишемического воздействия.мРНКр, U-testКИмРНКр, U-testКИBCL20,021,79MECP20,0052,05BCL2L110,0032,05NEUROD10,0131,49BCL2L10,0051,75NEUROD40,0291,96CASP90,0032,06NEUROD60,0011,73CREB10,0131,68NFKB10,0291,75EGLN10,0291,77NOTCH10,0201,77EGLN20,0012,81NOTCH30,0431,60HES10,0011,80PPARGC1A0,0052,08HIC10,0431,70RELA0,0081,76IKBKB0,0081,59SOX20,0132,13MCL10,0051,6467А)Б)*****В)*Рисунок 11. Уровни нормированной на ACTB экспрессии HES1 (А), PPARGC1A(Б) и FAS (В), выделенных из коры правого полушария ишемизированных крысчерез 24 часа (24ч) и 48 часов (48ч), а также у ложнооперироанных животных.Данные представлены в виде медианы и квартилей.
Точкой обозначены выбросы– значения, которые больше 3го квартиля или меньше 1го на 1,5хИКР; где ИКР –расстояние между 1м и 3м квартилем. * - p < 0,05, ** - p < 0,01, *** - p < 0,001,для несвязаннаых выборок по U критерию Манна-Уитни.Была построена линейная регрессионная модель взаимодействия междуэкспрессией в ткани мозга мкРНК и их возможных генов мишеней. Статистически68значимая взаимосвязь была выявлена только для генов: BCL2 (достоверно дляпредикторов miR-212-3p, miR-125b-5p, miR-376b-5p и имеющую теденцию кдостоеверности для miR-497-5p и miR-30b-3p) и BCL2L2 (дотоверно дляпредиктора – let-7i-5p и тенденция к достоверности для miR-497-5p).
Былаопределена стойкая отрицательная корреляция между экспрессией let-7i-5p и геномBCL2L2 (ρ = -0,69, p < 0,001). Для гена AIFM1(достоверно для предикторов – miR186-5p и let-7i-3p) значение статистической значимости модели составляло 0,057.3.4 Анализ клинических данныхВ рамках данной работы было обслеовано 10 больных с острым инсультом и10 волонтеров. Данные клинического анализа приведены в таблице 8.Статистически значимых различий в демографических и сосудистых факторовриска между больными и группой контроля обнаружено не было.Все больные были разделены на 2 группы: группа 1 – пациенты сувеличением показателя по шкале NIHSS на 8-е сутки (4 больных) и группа 2 –пациенты с уменьшением данного параметра (6 больных). Соответственно в первойгруппе были пациенты с ухудшением неврологического статуса, а во второй сулучшением.В исследовании экспрессии мкРНК в плазме крови пациентов с инсультом иконтрольной выборки наиболее стабильной мкРНК оказалась miR-21-5p с SSSравным 2,68.
Однако, по сравнению с данными, приведенными в статье Марабата[97] и полученными в эксперименте с лабораторными животными, такое значениеSSS является крайне большим, что говорит о недостаточной стабильности данноймкРНК. Кроме того, есть работы, свидетельствующие о том, что miR-21-5p можетявляться одним из биомаркеров ишемического инсульта [162], что ставит подсомнение пригодность данной мкРНК в качестве внутреннего контроля. Такимобразом, было решено отказаться от использования конкретной мкРНК в качествеэндогенного контроля в экспериментах по анализу экспрессии мкРНК в плазме69крови, и определять экспрессию мкРНК, опираясь на немодифицированныеотносительное количество мкРНК (RQ), как рекомендует фирма Qiagen [119].Таблица 8. Клинические характеристики пациентов и контрольной выборки.КонтрольнаяПациентыpвыборкаКоличество человек1010-Пол (М/Ж)5/55/51Возраст (среднее ±стандартная ошибка среднего),года64,5±2,962±2,20,51Артериальная гипертензия, %50%30%0,36Атеросклероз40%--Наличие сахарного диабета, %40%30%0,645338,55--4/6--NIHSS первые сутки (медиана)11,5--NIHSS восьмые сутки(медиана)9,5--Объем поражения мозга(медиана), мм3Локализация поражения (левоеполушарие доля/правоеполушарие)Были проанализированы значения экспрессии 45 мкРНК, выделенных изплазмы крови пациентов, а также контрольной выборки.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
