Диссертация (1174327), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Однако, несмотря на такое противоречие, полученные в настоящей работе данные о сниженииеё экспрессия в плазме крови всех наблюдаемых нами пациентов указывают навозможную диагностическую значимость. Анализ ROC кривых показал значениеAUC для miR-23a-3p 79,9% при RQ = 11,2*10-3 и значениями чувствительности испецифичности88,9%и81,2%соответственно.Подобныепоказателисвидетельствуют о потенциальной возможности использовать miR-23a-3p вкачестве биомаркера ИИ.У пациентов происходило увеличение экспрессии miR-22-5p на восьмыесутки по сравнению с первыми. Такое направление изменения экспрессии общеедля эксперимента и клиники. Судя по литературным данным, значимость miR-225p в патогенезе инсульта не была выявлена, однако, в клинических исследованияхбыла установлена роль этой мкРНК в развитии инфаркта миокарда, где повышениеэкспрессии miR-22-5p было характерно для больных в острой фазе [95], чтосоответсвует нашим данным.
Также как и со значениями экспрессии miR-22-5p иmiR-22-3p у экспериментальных животных, корреляция в плазме крови пациентовбыла обратной, хотя и статистически не значимой. Судя по литературным даннымгиперэкспрессия «ведущей» цепи данной мкРНК давало протективный эффект приишемии миокарда [27].УпациентоввпервойгруппемкРНКmiR-99a-5pбылатакжегиперэкспрессированной, как и в эксперименте с животными. Судя политературным данным, miR-99a-5p предположительно участвует в патогенезеинсульта и может служить его биомаркером. Однако, данные об экспрессииmiR-99a-5p в крови больных разнятся. Так есть сведения, как о ее гипер [160], таки о гипоэкспрессии [136] в плазме крови и лейкоцитах. Пока невозможно сказатьявляется ли данная мкРНК прогностическим фактором и чем обусловленоповышение ее уровня в группе больных с ухудшением состояния на 8ые сутки.89Хотя была установлена дифференциальная экспрессия miR-223-3p уэкспериментальных животных, определить ее статистически значимое изменениев плазме всех пациентов с инсультом не удалось (КИ = 0,79, p = 0,41).
При разбивкепациентов на группы (по изменению неврологического статуса на 8ые сутки), былоустановлено, что экспрессия данной мкРНК выше у больных с улучшениемсостояния (вторая группа) нежели с ухудшением (первая группа). При этомэкспрессия данной мкРНК на первые сутки имеет тенденцию к снижению упациентов с ухудшением состояния по сравнению с контрольной выборкой (КИ =0,32, p = 0,058). Данная мкРНК теоретически может быть прогностическимфактором инсульта, однако это предположение требуют дополнительногоисследования с большей выборкой, нежели в рамках настоящего эксперимента.В отличии от данных, полученных на экспериментальных животных, найтизначимых отличий в экспрессии miR-497-5p у больных с инсультом не удалось,Была обнаружена только тенденция к достоверности (p = 0,087) различий междуэкспрессией miR-497-5p у всех больных с инсультом на первые сутки иконтрольной выборкой.
Работ, посвященных экспрессии данной мкРНК в плазмебольных инсультом также обнаружить не удалось, однако, есть исследование,посвященное определению экспрессии miR-497-5p в плазме больных инфарктоммиокарда [82]. В данной работе показано, что экспрессия этой мкРНК значительноварьируется в зависимости от времени, прошедшего с начала заболевания. Приэтом наибольшая экспрессия miR-497-5p достигается через 8 часов, а уже через 48часов нет значимых отличий в экспрессии данной мкРНК. Эта информация даетвозможность предположить реактивный характер изменения экспрессии miR-4975p в плазме крови больных, поэтому ее концентрация зависит не от сутокпрошедших с момента инсульта, а часов или даже минут.мкРНК miR-92b-3p в экспериментальной части с животными не показаласвою важную роль: ее экспрессия статистически значимо возрастала только через24 часа в неишемизированном полушарии.
Но в клинической части исследования,у пациентов второй группы наблюдалась значимое ее увеличение (КИ = 5,2) навосьмые сутки по сравнению с первыми. Также обнаружена разница в экспрессии90miR-92b-3p между женщинами и мужчинами, как в контрольной выборке, так и убольных с инсультом. В целом, экспрессия miR-92b-3p была ниже у мужчин инаблюдалась положительная динамика ее изменения на 8ые сутки после инсульта.Один из генов, экспрессию которого регулирует miR-92b-3p – это Gabra3 [90], онрасположен на длинном плече X хромосомы и отвечает за синтез одной изсубъединиц ГАМК рецептора. Было показано, что плотность этих рецепторовпосле инсульта значительно уменьшается [108], а уменьшение ГАМК-эргическогоингибирования коррелирует с восстановлением двигательных функций пациентов[17]. Исходя из этого можно предположить, что увеличение экспрессии этоймкРНК играет нейропротективную роль.91ЗаключениеНа модели фотохимически индуцируемого тромбоза при использованииметода количественной ОТ-ПЦР в реальном времени была оценена экспрессия 45ти мкРНК в ткани мозга и лейкоцитах крови крыс через 24 и 48 часов послевоздействия.
Был определен паттерн индуцированных ишемией мкРНК и их геновмишеней. Также впервые была показана разница в экспрессии ряда мкРНК в левоми правом полушарии животных после фотохимически индуцированного тромбоза.Такая разница может объясняться активацией разных сигнальных путей в очагеповреждения и в контрлатеральной области.
Была обнаружена тенденция кповышению экспрессии исследуемых мкРНК через 48 часов в ткани головногомозга и лейкоцитах крови крыс. Это может быть следствием процесса воспаления,эндотелиальной дисфункции, нарушения проницаемости гематоэнцефалическогобарьера, вызванных ишемическим воздействием.Было обнаружено увеличение экспрессии анти-апоптотических генов(BCL2L1, BCL2L2, BCL2) в контрлатеральном полушарии по сравнению сишемизированном. А также определены некоторые мкРНК, которые вероятнорегулируют экспрессию этих генов (miR-497-5p, let-7i-5p).При сравнении профилей экспрессии мкРНК, выделенных из плазмы кровипациентов и здоровых волонтеров были обнаружены значимые отличия.
Болеетого, были показаны изменения профилей мкРНК в зависимости от стадииинсульта и от пола больного. В итоге это позволило определить ряд мкРНК (let-7i3p и miR-23a-3p), которые потенциально могут быть дополнительнымибиомаркерами ишемического инсульта. Найти мкРНК, которые достоверно могутслужитьпрогностическимифакторамизаболеванияврамкахданногоисследования не удалось в связи с маленькой выборкой больных с ишемическиминсультом. Однако, полученные данные позволяют рекомендовать определятьэкспрессию miR-99a-5p и miR-223-3p в качестве возможных маркеров негативнойдинамики инсульта.92В заключении необходимо отметить, что данная работа если не решает, топриближает решение одной из проблем применения мкРНК в клиническойпрактике: трансляционность исследования.
Оригинальный дизайн экспериментапозволил сопоставить данные, получаемые на лабораторных животных склиническими данными. Более того, в рамках настоящей работы былапредставлена выборка пациентов и группы контроля, состоящая из представителейне азиатской популяции (популяции России), что является редкостью для такогоисследования.93Выводы1. У крыс с фокальной ишемией были определены 41 дифференциальноэкспрессирующаяся мкРНК в ткани мозга и лейкоцитах крови; впервыепоказаныразличиявэкспрессиимкРНКвишемизированномиконтрлатеральном – «интактном» участках мозга;2. Кластерный анализ показал, что уровни экспрессии выбранных мкРНК в левом(ишемизированном) полушарии образуют кластеры, соответствующие ихфизиологическим группам.
Корреляция между экспрессией мкРНК в мозге и влейкоцитах крови крыс была как прямой, так и обратной;3. В ткани ишемизированного полушария мозга крыс после фотохимическииндуцированноготромбозаобнаружено13дифференциальноэкспрессирующихся генов: ген нейрогенеза NEUROD1 был гипоэкспрессированкак через 24, так и через 48 часов после ишемии, тогда как остальные гены,участвующие в процессах воспаления (NFKB2, TNF, FOS), апоптоза (BCL2L2),нейрогенеза (NEUROG3, NEUROG2, NEUROG1, NOTCH3) и транскрипции(HES5, ATOH1, HIC1, CREB1) были гипоэкспрессированы только через 48 часов.4.
Установлена взаимосвязь между экспрессией гена BCL2 с экспрессией мкРНКmiR-212-3p, miR-125b-5p и miR-376b-5p (p = 0,016), а также экспрессией генаBCL2L2 с экспрессией let-7i-5p (p = 0,029);5. У больных с ишемическим инсультом в плазме крови было обнаружено 5дифференциально экспрессирующихся мкРНК: у всех пациентов на первыесутки инсульта по сравнению с контрольной выборкой (гипоэкспрессия let-7i3p и miR-23a-3p); у всех пациентов на восьмые сутки инсульта по сравнению сконтрольной выборкой (гипоэкспрессия, miR-22-5p); у пациентов на восьмыесутки по сравнению с первыми сутками инсульта (гиперэкспрессия miR-22-3p иlet-7i-3p для всех пациентов и гиперэкспрессия let-7i-3p и miR-92b-3p дляпациентов с улучшением состояния на восьмые сутки);6.
По совокупности данных лабораторной и клинической части исследования(взаимодействие с генами мишенями и анализ ROC кривой), возможно94предложить использование let-7i-3p и miR-23a-3p в качестве потенциальныхбиомаркеров ишемического инсульта на первые сутки после поражения спороговым нормированным значением экспрессии 0,4*10-4 и 11,2*10-3соответственно;7. Понижение экспрессии miR-223-3p и повышение экспрессии miR-99a-5p вплазме крови пациентов могут служить потенциальными прогностическимифакторами ухудшения неврологического статуса.95Практические рекомендации1.
Рекомендуется создание клинико-генетических баз данных пациентов сишемией мозга, включающих результаты клинико-лабораторного имолекулярно-генетического обследования для идентификации и поиска спектраэпигенетических маркеров риска развития заболевания и прогнозированияисходов инсульта.2. В первые сутки заболевания мкРНК let-7i-3p (по совокупности полученныхэкспериментальных и клинико-генетических данных) можно рассматривать вкачестве перспективного нового биомаркера ишемического инсульта.3. Понижение экспрессии miR-223-3p и повышение экспрессии miR-99a-5p убольных с ухудшением состояния неврологического статуса позволяетвысказать предположение, что данные мкРНК могут быть прогностическимфактором инсульта, однако это предположение требуют дополнительногоисследования.96Перспективы дальнейшей разработки темы1.
Дальнейшее изучение дифференциально экспрессирующихся мкРНК на другихмоделях инсульта (например, перевязка средней мозговой артерии среперфузией и без) может углубить понимание биохимических процессов ироли генетических феноменов, происходящих при нарушении мозговогокровообращения.2. Определение расширенного списка дифференциально экспрессирующихсямкРНК у пациентов при инсульте в перспективе позволит использовать их вкачестве биомаркеров повреждения мозга, а также при лечении данногозаболевания.97Список использованных сокращений3’-UTR – 3'-нетранслируемая областьAIFM1 – Apoptosis-inducing factor 1, mitochondrial. Метохондриальный апоптозиндуциремый фактор 1AUC – площадь под ROC-кривойBcl-2 - B-cell lymphoma 2BDNF – нейротрофический фактор головного мозгаBMP – костный морфогенетический белокdNTP – дезоксинуклеозид трифосфатFADD – FAS ассоциированный домен смертиMCAO – middle cerebral artery occlusion, экспериментальная модель ишемииRISC – РНК индуцирующий сайленсинг комплексROC кривая – кривая рабочей характеристики приёмникаRQ – относительное количествоSMAD – лиганд-специфический передатчик сигналаTGF-beta – трансформирующий фактор бетаTNF – фактор некроза опухолейАГ – артериальная гипертензияАФК – активные формы кислородаЕА – единицы активностиИИ – ишемический инсультИКР – интерквартильное размахкДНК – комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислотаКИ – коэффициент изменениямиРНК - малые интерферирующие РНКмкРНК – микроРНКмРНК – матричная РНКмяРНК – малые ядерные РНКОТ – обратная транскрипция98п.н.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
