Диссертация (1174327), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Отчасти это можно объяснить тем, чтомкРНК могут ингибировать экспрессию генов не только через деградацию мРНКмишени, но и через предотвращение трансляции. А в вышеназванной работе былпроведен количественный анализ именно белка, но не мРНК.В последнее время проводится много исселдований экспрессии miR-223-3p,которая, как считается, участвует в регуляции клеточного цикла, опухолевойинвазии, дифференцировке гемопоэтических клеток и функционировании клетокиммунной системы [55].
miR-223-3p экспрессируется, в основном, в костном мозгеи играет важную роль в гранулопоэзе [64]. Ее гиперэкспрессия индуцируетснижение уровней цитокинов IL-6 и IL-1 в TLR-активированных макрофагах [23].Предполагается, что в головном мозге miR-223-3p выступает в роли главногорегулятора экспрессии субъединиц глутаматного рецептора GluR2 и NR2B,являющихся ее мишенями. При увеличении miR-223-3p в мозге, уровеньэкспрессии этих рецепторов снижается, тем самым происходит ингибированиеNMDA-индуцированный приток кальция в нейроны гиппокампа, что защищаетмозг от эксайтотоксичности.
Возможно этот механизм определяет наблюдаемоетерапевтическое действие miR-223-3p при ишемии в различных экспериментах84[56]. Ранее была показана гиперэкспрессия miR-223-3p в крови и ткани мозгаживотных на модели MCAO, а также в крови пациентов с острым инсультом [6, 11,41, 42]. Полученные нами результаты экспрессии данной мкРНК в ткани мозга икрови крыс полностью согласуются с данными других авторов, подтверждают иуглубляют их: экспрессия miR-223-3p через 24 часа после ишемии в левомполушарии мозга крыс повышается в 2,6 раза, а в лейкоцитах крови в 1,9 раз; через48 часов ее уровень повышен в 10 раз в ткани мозга и в 2,8 раз в лейкоцитах крови.Стоит отметить, что дифференциальных отличий в экспрессии данной мкРНК вправом полушарии ни через 24, ни через 48 часов после ишемии обнаружить неудалось.
Тот факт, что в ответ на ишемию экспрессия miR-223-3p значительноповышается не только в ткани мозга, но и в лейкоцитах крови, дает возможностьпредположить, что она вовлечении в механизмы воспаления и иммунного ответа.Ранее было показано, что miR-497-5p в условиях ишемического воздействияингибирует трансляцию анти-апоптотических генов BCL2 и BCL2L2, путемсвязывания с их 3-нетранслируемой областью [154]. В исследовании былообнаружено, что через сутки после реперфузии в головном мозге мышей (модельMCAО) и в культуре нейронов после кислородно-глюкозной депривацииэкспрессия белка BCL2L2 значительно снижалась, а miR-497-5p повышалась.Также было показано, что при супрессии miR-497-5p с помощью специфическогоингибитора, уровень BCL-2 и BCL2L2 повышался, что приводило к уменьшениюочага ишемии и неврологического дефицита. В нашем эксперименте экспрессияmiR-497-5p также была статистически значимо повышена как в левом, так и вправом полушарии крыс через 48 часов после фотохимически индуцируемоготромбоза.
При этом, статистически значимое повышение экспрессии этой мкРНК влейкоцитах крови наблюдалось только через 24 часа. Возможно, изменениеэкспрессии miR-497-5p через 24 часа в лейкоцитах обусловлено первичнымзапуском воспалительной реакции, пролонгированный эффект от которойнаблюдается через 48 часов в самой ткани.Также стоит отметить, что косвено была подтверждена связь междуэкспрессией miR-497-5p и BCL2L2. Это было показано и на линейной85статистической модели, где в качестве предикторов были взяты все мкРНК,которые теоретически могут взаимодействовать с этим геном, и при анализекорреляции между экспрессией miR-497-5p и BCL2L2, как в левом, так и в правомполушарии мозга крыс. Сама экспрессия данного гена была статистически значимоснижена в левом полушарии мозга ишемизированных крыс.
Это согласуется слитературными данными и говорит о снижении роли анти-апоптотическихмеханизмов в первые дни после ишемии мозга [154].Как и в случае с BCL2L2 было показана возможная взаимосвязь междуэкспрессией BCL2 и miR-497-5p на линейной статистической модели (p=0,08). Вотличии от левого полушария экспрессия BCL2 была статистически значимоувеличена через 48 часов после ишемии, также как и экспрессия другого антиапоптотического гена BCL2L1. Это може говорить о более выраженном антиапоптотическомэффектев«интактном»полушарии,посравнениюсишемизированном у экспериментальных животных.Другим геном мишенью для miR-497-5p теоретически является NEUROD1.
Внашем эксперименте его экспрессия статистически значимо понижалась на первыесутки после фотохимически индуцированного тромбоза, но при этом значительноувеличивалась ко вторым суткам. Корреляция между значениями экспрессииNEUROD1 и miR-497-5p на первые сутки после ишемии была положительная, ноне достоверная. Последние исследования свидетельствуют о том, что NEUROD1может содействовать нейрогенезу и уменьшать сигналинг реактивных астроцитовпосле ишемии мозга [26]. Необходимость нейрогенеза в период восстановленияобъясняет увеличение экспрессии данного гена на вторые сутки после ишемии.В итоге, мкРНК miR-497-5p вероятно может регулировать экспрессию как иантиапоптотических, так и генов нейрогенеза, что обуславливает такой временнойпаттерн ее экспрессии.ДругоймкРНК,котораяизменяетсвойпрофильэкспрессииприишемическом повреждении является miR-27a-5p.
В нашем исследовании ееэкспрессия у ишемизированных крыс увеличивается через 24 часа послефотохимически индуцированного тромбоза в левом и правом полушарии мозга, а86через 48 часов в правом полушарии и в. лейкоцитах крови. Подобное увеличениеэкспрессии данной мкРНК описано в ряде литературных источников [128], однакомеханизмы и причины данного феномена до сих пор остаются полностью неизученными. Данная мкРНК теоретически может регулировать множество генов,участвующих в патогенезе ишемии мозга (BCL2, NEUROG3, STAT3) [72], однакодостоверно доказать их взаимосвязь ни нам, ни другим ученым пока не удалось.4.3 Обсуждение результатов клинической части исследованияУ пациентов после ИИ был проведен анализ экспрессии тех же самых мкРНКв плазме крови. Полученные результаты не полностью совпадают с теми, что былиопределены у крыс.
Например, разнится направление изменения экспрессии частимкРНК семейства let-7. Значения экспрессии let-7f-5p в плазме крови пациентов синсультом незначительно снижается, тогда как в ткани мозга и в лейкоцитах кровикрыс наблюдается увеличение данной мкРНК через 24 и 48 часов после ишемии. Вотличии от экспериментальных данных, содержание let-7i-3p в плазме крови всехпациентов в целом, так и во второй группе в отдельности было достоверно ниже напервые сутки по сравнению с контрольной выборкой. При этом экспрессия данноймкРНК достоверно увеличивалась во второй группе пациентов на восьмые сутки,по сравнению с первыми (в данном случае сохраняется то же направлениеизменения экспрессии, что и в эксперименте).
Стоит отметить, что среднеезначение уровня экспрессии let-7i-3p у первой группы пациентов было выше, чему второй, хотя и был больший разброс в значениях. Ранее было установлено, чтоповышение экспрессии let-7i-3p характерно для болезни Паркинсона [25].Как было уже сказано, есть сведения, что экспрессия «направляющей» цепиlet-7i-5p значимо уменьшается в крови пациентов после инсульта [62]. В нашейработе значение экспрессии let-7i-5p также уменьшалось после инсульта(статистически не значимо) и положительно коррелировало со значениемэкспрессии let-7i-3p у пациентов на первые сутки после инсульта (ρ = 0,692, p =0,04).
Более того, нами было показано, что экспрессия let-7i-5p статистически87значимо различается у мужчин и у женщин, как в группе контроля, так и упациентов. Статистически значимые отличия были обнаружены в экспрессииданной мкРНК у пациентов мужчин на первые сутки после инсульта по сравнениюс контрольной выборкой мужчин. При этом подобных отличий у женщинобнаружить не удалось. Выявленные половые различияной в экспрессии let-7i-5p вцелом соответствуют литературным данным: есть сведения, что мкРНК семействаlet-7 коррелируют с возрастом и полом [121], а также влияют на уровень эстрогена[32], который обладает нейропротективным действием.Для проверки гипотезы использования let-7i-3p в качестве биомаркера былапостроена ROC кривая по значениям экспрессии данной мкРНК и по категориям«группа контроля», «пациенты с ИИ».
Для подбора оптимального референсногозначения для дифференцировки групп необходима большая выборка, но используянаши данные, мы пришли к выводу, что мкРНК let-7i-3p с пороговым значениемRQ = 0,4*10-4 дает 100% специфичность и 66,7% чувствительность со значениемAUC 86,7%. Поэтому хотя let-7i-3p ранее не рассматривалась в качествебиомаркера для ИИ, но по совокупности клинических и экспериментальныхданных (изменение профиля экспрессии мкРНК и ее генов-мишеней) возможнорассматриватьэтумкРНКвкачествеперспективногоновогомаркераишемического инсульта в первые сутки поражения.В плазме крови больных определить какие-либо статистически значимыеизменения в экспрессии мкРНК семейства mir-30 не удалось. Однако, направлениеизменений, которые были обнаружены у мкРНК соответствовали описанным влитературных источниках: miR-30a-5p и miR-30c-5p гипоэкспрессированы (КИ =0,4 и 0,8 соответственно) [89, 128], а miR-30c-1-3p гиперкспрессирована на первыесутки после инсульта, и ее экспрессия снижается на восьмые [85].
Возможноотсутствие достоверности изменений в данном эксперименте связано сгетеронностью (размером и локализацией поражения) и малочисленностьювыборки.Значение экспрессия miR-23a-3p уменьшалась в плазме крови больных напервый день после инсульта. Это противоречит, полученным экспериментальным88результатам, где экспрессия данной мкРНК увеличивалась. Такой же парадоксприсутствуетвпубликацияхдругихавторов,укоторыхнаблюдаласьгипоэкспрессия miR-23a-3p в образцах переферической крови больных [128] игиперэкспрессия в очаге некроза мозга лабораторных животных [158].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
