Диссертация (1174327), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Также было учтено, что выбранные мкРНК и мРНК экспрессируются в тканимозга (кора и/или гиппокамп). В общей сложности было отобрано 45 мкРНК и 50генов-мишеней, участвующих в вышеуказанных процессах.При помощи сервиса mirWalk 3.0 [36] была составлеа таблица возможныхвзаимодействий между выбранными мкРНК и генами-мишенями.
Этот сервис припомощи бионформатической модели рассчитывает вероятность полного иличастично-комплементарного взаимодействия мкРНК с тем или иным участкомгена-мишени (3’ или 5’ нетранслируемая область, а также кодирующий регион).Данные фильтровались по значению p (<0,05) и по региону прикрепления (только3’ нетранслируемая область).Праймеры для выбранных мкРНК, эндогенных контролей и контролейпрохождения ПЦР были получены у фирмы Qiagen. Они были лифиолизированына 96-ти луночном ПЦР планшете – Custom miScript miRNA PCR Array (QIAGEN,Германия).Праймеры для генов-мишеней и их эндогенных контролей подбирались припомощи программы Primer 3 и были предоставлены фирмой Евроген.482.2.4 Метод обратной транскрипции мкРНК и мРНКМетод обратной транскрипции (ОТ) использовали для образования кДНК наматрице мкРНК и мРНК. Для проведения ОТ мкРНК применяли набор miScript IIRT Kit (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя[117].
ОТ проводилась при оптимуме температур 37 °C, денатурация обратнойтранскриптазы проходила при 95 °C.ОТ мРНК генов-мишеней проводилась с использованием фермента обратнойтранскриптазы M-MLV (M-MLV Reverse Transcriptase, Promega), смеси dNTP и 6членных random-праймеров в соответствии с инструкцией фирмы-производителя.На 1 мкг РНК использовалось 100 ЕА обратной транскриптазы M-MLV.2.2.5 Количественная ПЦР в реальном времени для определения уровняэкспрессии мкРНК и мРНКДанный метод служит для определения абсолютного или относительногоколичества ДНК в пробе. Для количественной ПЦР в реальном временииспользовали наборы miScript SYBR Green PCR Kit, Custom miScript miRNA PCRArray (QIAGEN, Германия), iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, США).Количественную ПЦР в реальном времени для определения экспрессиимкРНК проводили согласно протоколу фирмы изготовителя.
кДНК смешивалась вопределённой пропорции с буферным раствором, содержащим краситель SybrGreen, универсальным обратным праймером, полимеразой и доводилось водой безнуклеаз до объема 25 мкл. Этот мастермикс раскапывался по лункам планшета,содержащего уникальный прямой праймер. После центрифугированиясотносительной силой 1000 x g, планшет помещался в амплификатор CFX96 RealTime PCR Detection System. Программа амплификации была выбрано согласнозаводскому протоколу [118].
Фильтр амплификатора был настроен на флюорофорSybr Green, время и температура амплификации, а также скорость нагрева приборабыливыставленысогласнорекомендациямпроизводителяреактивов.К49рекомендованной схеме амплификации был добавлен этап построения кривыхплавления для дальнейшего анализа качества ПЦР.Первичная обработка данных проводилась при помощи программы Bio-RadCFX Manager. Для анализа экспрессии мкРНК в биоптате мозга и крови крысэндогенным контролем служили 2 мяРНК - SNORD61, SNORD72.
В качествеэндогенного контроля для анализа экспрессии мкРНК в плазме служилаискусственная мкРНК – cel-miR-39.Для каждого из типов образцов мкРНК (выделенные из биоптата мозга,лейкоцитов крови или плазмы) была выбрана единая величина порогового уровня,относительно которой вычислялись значения Ct.Для каждого образца вычисляли значение RQ, считая эффективность ПЦРравной 100%: = ( × 2)control −miRNA ,где E – эффективность ПЦР реакци, Ctcontrol – усредненное значение Ct дляконтрольной мкРНК у каждого образца; CtmiRNA – усредненное значение Ct каждоймкРНК у каждого образца.Количественная ПЦР в реальном времени для детекции экспрессии мРНКпроводилась при помощи готового набора iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad,США).
В ПЦР реакцию объемом 15мкл добавлялось 1,5 мкл 5х мастермикса, 333нМ прямого и обратного праймера, 15 нг кДНК. Для выбора оптимальных условийдля каждой из пар праймеров при ПЦР на стадии отжига делали градиенттемператур (55°С-68°С), а также в конце реакции добавляли этап построениякривых плавления. После реакции по совокупности данных (значение Ct, формакривой плавления и др.) выбирались оптимальные температурные условия дляконкретной пары праймеров.
Генами эндогенного контроля служил GAPDH иACTB. При этом эффективность ПЦР реакции высчитывалась индивидуально длякаждой из пары праймеров при помощи построения стандартных кривыхразведения.Для каждого образца вычисляли значение RQ гена аналогично тому, какделали с мкРНК.502.2.6 Статистическая обработка данныхСтатистический анализ и визуализация полученных данных проводились всреде программирования R [120] и программе cluster 3.0 [57].
Для определенияформы распределения данных был применен тест Шапира-Уилка. Описательнаястатистика для нормального распределения представлена в виде среднего ±стандартная ошибка среднего, для ненормального в виде медианы [первыйквартиль, третий квартиль], а для категориальных данных в виде процентов ичастот. Для оценки различий между несвязанными выборками с нормальнымраспределением использовали t-тест Стьюдента, с ненормальным распределением– U критерий Манна-Уитни, а между связанными выборками – критерийУилкоксона.
Некоторые мкРНК имели значения Ct больше 35 или оно вообщеотсутствовало. Для таких мкРНК при расчете критерия Уилкоксона, мы неучитывали значения образцов, где был «выброс». Сравнение категориальныхданных проводилось с использованием точного теста Фишера. Критерий Фишера(F-тест) также использовался для проверки значимости линейной регрессии. Дляопределения корреляции использовался корреляционный анализ по методуСпирмена.ИерархическоекластерированиезначенийэкспрессиймкРНКосуществлялось следующим образом:1) Подготовка данных [38].a. Лог-трансформация всех данных,b.
Центрирование по медиане мкРНК и образцовc. Нормализация мкРНК и образцов2) Кластерирование данных по мкРНК и образцам при следующихпараметрах: метрика – корреляция по Пирсону, алгоритм кластеризации –метод «средней связи».3) Построение тепловой карты значений нормированной экспрессии мкРНКс дендрограммой, иллюстрирующей «расстояние» между кластерами.Дифференциация больных с инсультом и группы сравнения осуществляласьс помощью анализа ROC кривой (операционная характеристика приёмника) и51значение площади под кривой (AUC).
Для каждой мкРНК определяли оптимальноезначениеточкиспецифичности.отсеченияпонаибольшейсуммечувствительностии52Глава 3. Результаты3.1 Дифференциальная экспрессия мкРНК в ткани головного мозга крыс,подвергшихся фотохимически индуцированного тромбозуСогласно рекомендациям, предложенным Марабита с соавторами [97]осуществлялся поиск стабильных мкРНК для последующего определениянормированного значения относительной экспрессии. Среди 45ти, представленныхмкРНК были выбраны те, чьи значения Ct у всех образцов не превышали 35тициклов.
Для этих мкРНК были посчитаны значения стабильности с использованиемалгоритмов geNorm (ScoregeNorm) [141], Normfinder (ScoreNormfinder) [13] , а такжеалгоритма, основанного на коэффициенте вариации (ScoreCV). Для определениянаиболее стабильных мкРНК использовали суммарный коэффициент стабильности(SSS), который вычисляли как квадратный корень от суммы квадратов всехвышеуказанных коэффициентов.2SSS = √ScoregeNorm2 + ScoreNormfinder 2 + ScoreCV 2Чем меньше значение данного коэффициента, тем более стабильной являетсямкРНК.
В исследовании экспрессии мкРНК в биоптате и крови крыс наиболеестабильной оказался SNORD61 (SSS = 1,37 и 1,41 соответственно). При этомэкспрессия SNORD72 была нестабильной (SSS = 1,83 и 1,82 соответственно),поэтому было решено не использовать данную мяРНК для нормировки данных.Сравнительный анализ экспрессии мкРНК в коре левого (ишемизированного)полушария головного мозга крыс показал, что в группах экспериментальныхживотных через 24 и 48 часов после фотохимически индуцированного тромбозауровни экспрессии 35 из 45 исследованных мкРНК различаются более чем в 1,5раза.Срединих,вобразцах,взятыхчерез24часапослеишемии,идентифицировано 9 мкРНК, экспрессия которых изменялась в пределах 1,5–4,3раз по сравнению с ложнооперированными животными (КИ – кратностьизменений): miR-124-3p (КИ = 1,52), miR-129-5p (КИ = 1,51), miR-9a-5p (КИ = 1,56),miR-181b-5p (КИ = 2,19), miR-27a-5p (КИ = 2,26), let-7f-5p (КИ = 2,38), miR-223-3p53(КИ = 2,64), miR-21-5p (КИ = 3,19) и miR-200b-3p (КИ = 4,38).
При этомдостоверные отличия в уровнях экспрессии (p < 0,05; U тест Манна-Уитни) былитолько у трех мкРНК: let-7f-5p, miR-27a-5p и miR-21-5p (Рисунок 7).*****Рисунок 7. Уровни нормированной на SNORD61 экспрессии мкРНК let-7f-5p (A),miR-21-5p (Б), и miR-27a-5p (В), выделенных из коры левого полушарияишемизированных крыс через 24 часа (24ч) и 48 часов (48ч), а также уложнооперироанных животных. Данные представлены в виде медианы иквартилей.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
