Диссертация (1174327), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Мало известно и о корреляции между количествомциркулирующих мкРНК и их экспрессией в ткани мозга. Но не возникает сомненийв том, что циркулирующие мкРНК могут быть важными звеньями патогенезаинсульта. В перспективе, возможно использование этих молекул в качествебиомаркеров тяжести ишемического повреждения мозга, прогностическихфакторов, а также терапевтических мишеней для лечения ишемии [140].1.2 микроРНК1.2.1 История открытия и общие сведениямикроРНК (англ. microRNA, miRNA) — класс некодирующих РНК, которыеимеют длину около 22 нуклеотидов.
мкРНК кодируются генами, которые впервыебыли обнаружены у Caenorhabditis elegans в 1993 году. После открытия первоймкРНК, lin-4 долгое время считалась единственной и уникальной (специфичнойдля нематод идиосинкразией), и только в 2000 году была обнаружена и описанамкРНК let-7, которая ингибирует экспрессию lin-41, lin-14, lin-28, lin-42 и daf-12 уC. Elegans [122]. Также было обнаружено, что данная мкРНК достаточноконсервативна и присутствует в других организмах [111]. Было также обнаружено,что эти молекулы участвуют в феномене, называемом РНК-интерференцией –процессе подавления экспрессии гена на стадии транскрипции, трансляции,деаденилирования или деградации мРНК. В 2006 году Эндрю Файер и Крейг Меллополучили Нобелевскую премию в области физиологии и медицины за работы поизучению РНК-интерференции у нематоды Caenorhabditis elegans, опубликованныев 1998 году.
В последующие годы было опубликовано большое количество статей,описывающих свойства и строение мкРНК и открыто множество новых мкРНК. Насегодняшний день, у человека было идентифицировано 2693 зрелых мкРНК [72].24На момент открытия мкРНК вопрос о названии этих молекул не стоял стольостро. На сегодняшний день приняты следующие правила названия мкРНК и ихпредшественников [12, 46]:1. Вначале идет трехбуквенное обозначение вида организма, геному которогоэта мкРНК принадлежит. Например «hsa» - Нomo sapiens, «rno» - Rattusnorvegicus, «mmu» - Mus musculus.2.
Все мкРНК называются по порядку и имеют приставку «miR». Первыеоткрытые мкРНК имеют название с приставкой «let». ПредшественникимкРНК (пре-мкРНК) обозначаются аналогичным образом, без заглавного«R» в приставке – «mir».3. После приставки идет порядковый номер мкРНК.4. Далее идут факультативные обозначения: если зрелая мкРНК имеют схожуюпоследовательность, но отличаются на один или два нуклеотида, тогда послеобщей цифровой части названия идет буквенное окончание. Например – hsamiR-30a-5pиhsa-miR-30e-5p(uguaaacauccucgacuggaagиuguaaacauccuugacuggaag)5.
Суффикс«-5p»или«-3p»обозначаетскакойцепипре-мкРНКтранскрибировалась зрелая молекула – со смысловой или антисмысловой.Ранее вместо суффикса использовали значок «*» для обозначения«пассажирской» цепи мкРНК – той, которая экспрессируется в гораздоменьшем количестве и реже присоединяется к комплексу Risc. «Ведущая» жецепь мкРНК не имела суффикса. Например – hsa-miR-30e – это hsa-miR-30e5p, а hsa-miR-30e* - это hsa-miR-30e-3p.6. Пре-мкРНК, которые процессируют одинаковые зрелые мкРНК, но при этомнаходятся в разных участках генома, имеют в названии дополнительныйчисловой суффикс. Например - hsa-mir-194-1 и hsa-mir-194-2, соответственно251.2.2 Биогенез мкРНКмкРНК транскрибируется из собственно генов-мишеней, из других генов(40%) или межгенного пространства (60%) при помощи РНК-полимеразы II [78].Гены, внутри которых находится участок, кодирующий мкРНК, называются хостгенами.
Эти участки чаще всего расположены на антисмысловой цепи хост-генов,поэтому мкРНК транскрибируются отдельными элементами [74], а если мкРНКлежит на смысловой цепи то, соответственно, она транскрибируются совместно сосвоим хост-геном [15, 103, 124]. В таком случае, можно говорить о том, чтоэкспрессия мкРНК связана с экспрессией хост-гена, например, экспрессия hsa-miR650 связана с экспрессией гена, кодирующего иммуноглобулин лямбда .
мкРНКтранскрибируется из собственно генов-мишеней, из других генов (40%) илимежгенного пространства (60%) при помощи РНК-полимеразы II [78]. Гены,внутри которых находится участок, кодирующий мкРНК, называются хост-генами.Эти участки чаще всего расположены на антисмысловой цепи хост-генов, поэтомумкРНК транскрибируются отдельными элементами [74], а если мкРНК лежит насмысловой цепи то, соответственно, она транскрибируются совместно со своимхост-геном [15, 70, 103]. В таком случае, можно говорить о том, что экспрессиямкРНК связана с экспрессией хост-гена, например, экспрессия hsa-miR-650 связанас экспрессией гена, кодирующего иммуноглобулин лямбда [103].По расположению внутри хост-гена, мкРНК можно разделить на две группы:мкРНК,располагающаясявнутриэкзоновхост-гена(16%);мкРНК,располагающаяся внутри интронов хост-гена (84%).Около 42%-48% мкРНК имеют общий промотор, включающий в себяотдельные петли, из которых процессируется зрелая мкРНК [11].
Однако, наличиеобщего промотора еще не говорит о сходстве в структуре и в функциях зрелоймкРНК. Более того, один и тот же предшественник мкРНК (прекурсор) можетдавать несколько видов мкРНК. Это так называемые изомиры [102]. Этот терминобозначает последовательности зрелых мкРНК, которые отличаются от изученныхмкРНК, но имеют один и тот же предшественник.
Благодаря современной26технологии глубокого секвенирования было выявлено, что один и тот же мкРНКпрекурсор может давать до семи различных вариаций зрелой мкРНК [28]. Такоеразнообразие зрелой мкРНК в геномах организмов существует благодаряразличным модификациям (Рисунок 1):1) Неизмененные – канонические мкРНК. Это те мкРНК, которыепроцессируются в большинстве случаев и их последовательностипредставлены в базах данных.2) Изменение 5’ конца – эта модификация создает новый сайт распознаваниядля фермента Dicer и\или Drosha. Новые сайты могут находиться «ниже»или «выше» исходных.3) Изменение 3' конца – эта модификация приводит к аналогичнымизменениям.4) Дополнение 3’ конца – эта модификация проявляется в присоединении«лишних» нуклеотидов к 3’- концу зрелой мкРНК, которые не были висходном предшественнике.
Чаще всего это происходит в результатеаденилирования или уридинилирования 3’-конца с использованиемнуклеотидных трансфераз [19, 151]5) Замена любого нуклеотида в последовательности зрелой мкРНК – этамодификация возникает по разным причинам, в частности в результатедезаминирования.6) Сдвиг исходной мкРНК – эта модификация смещает начало и конецзрелой мкРНК, но при этом ее длина остается прежней7) Смешенное изменение – это сочетание нескольких вышеперечисленныхмодификаций.27GGAAACCGTTACCATTACTGAGTTA— 10AACCGTTACCATTACTGAGTTA—9AACCGTTATCATTACTGAGTT—8GGAAACCGTTACCATTACTGAG—7ACCGTTACCATTACTGAGTTTA—6AAACCGTTACCATTACTGAGTTTA— 5AAACCGTTACCATTACTGA— 4CCGTTACCATTACTGAGTT— 312AGGAAACCGTTACCATTACTGAGTT— 2AAGGAAACCGTTACCATTACTGAGTT— 1CTTGGGAATGGCAAGGAAACCGTTACCATTACTGAGTTTAGTAATGGTAATGGTTCTCTTGCTATACCCAGA — 11Рисунок 1.
Пример модификации мкРНК hsa-mir-45. 1 – каноническая мкРНК; 2,3 – модификации 5’- конца мкРНК; 4,5 – модификации 3’- мкРНК; 6, 7 – сдвигисходной мкРНК; 8 – замена нуклеотида в последовательности зрелой мкРНК, 9– дополнение 3’-конца; 10 – смешенная модификация (дополнение 3’- конца имодификация 5’- конца); 11,12 – структурная схема петли пре-мкРНК [28, 71].Метод глубокого секвенирования сопряжен с некоторой долей ошибочныхрезультатов, в частности, в результате деградации образцов при пробоподготовке.Поэтому теория о модификациях мкРНК проверялась многими исследователями[37, 51, 109]. Наиболее полные и достоверные доказательства правомерноститеории модификации были представлены Ли с соавт [75].1.2.3 Созревание и деградация микроРНКмкРНК проходит многоэтапный процесс созревания до воздействия натрансляцию белка.
Пути созревания мкРНК можно условно поделить на основнойили канонический путь созревания, который происходит у большинства мкРНК иальтернативный или неканонический [20].Основной путь созревания мкРНК происходит в ядре клетки (Рисунок 2).Гены мкРНК чаще всего транскрибируются с помощью РНК полимеразы II. Поокончании транскрипции образуется первичная мкРНК – при-мкРНК. Зачастуюмножество шпилек при-мкРНК могут кодироваться одним участком гена. ПримкРНК представляет собой петлю, один конец которой кепирован, а другой –полиаденелирован [22, 78].
На следующем этапе происходит специфическое28узнавание и вырезание участка при-мкРНК с помощью Рибонуклеазы III, котораяносит общее название Drosha, и РНК-связывающего белка DGCR8, под названиемPasha – Partner of Drosha [54, 77]. Объединившись, эти два белка образуютмикропроцессорный комплекс. Pasha распознает последовательность «стебля»при-мкРНК длиной 10 нуклеотидов, после чего этот участок расщепляетсяферментом Drosha. Получившаяся петля является мкРНК-прекурсором и имеетдлину 55-70 п.н. [152]. Одна при-мкРНК может содержать до шести пре-мкРНК.29Рисунок 2. Путь созревания мкРНК у животных. А.
Основной (канонический)путь созревания мкРНК. Гены транскрибируются РНК-полимеразой II или III вдлинные транскрипты, называемые при-мкРНК. Они расщепляются ферментомDrosha и DGCR8 в промежуточную форму – пре-мкРНК. Пре-мкРНКтранспортируется через мембрану ядра в цитоплазму белком переносчиком –экспортином-5. В цитоплазме пре-мкРНК расщепляется белком Dicer и образуетмкРНК-дуплекс, который объединяется в комплекс RISC. В зависимости отстепени комплементарности направляющей цепочки мкРНК к целевой мРНК,последняя может или полностью деградировать, или же мкРНК можетрепрессировать трансляцию белка, кодируемого мРНК.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
