Диссертация (1174327), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Б. Альтернативный путьсозревания мкРНК (через миртроны). Миртрон после взаимодействия сосплайсосомой и специальным разворачивающим ферментом также становитсяпре-мкРНК. Дальнейшее развитие идет по основному пути. На уровне пре-мкРНКдезаминирование аденозина блокирует сайт распознавания фермента Drosha, науровне при-мкРНК идет блокирование сайта Dicer. мкРНК, которая неподвергается процессингу деградирует, в цитоплазме млекопитающих, за чтоответственен фермент Tudor-SN [42].30Большинство при-мкРНК расщепляются в пре-мкРНК основным путем(Рисунок 3 а), однако существует ряд исключений.
Для успешного расщеплениянекоторых при-мкРНК необходимо наличие расширенного микропроцессорногокомплекса, который включает не только Drosha и Pasha, а также и РНК-хеликазы(например, p68 и p72), белок, связывающий двухцепочечные фрагменты РНК,гетерогенные ядерные рибонуклеопротеины и белки саркомы Юинга (Рисунок 3 b).Существует индивидуальная регуляция некоторых мкРНК. Так, hnRNP A1 гетерогенный ядерный рибопротеин A1, может специфически присоединяться кконсервативной петле pri-miR-18a и менять ее конформацию.
Это создает болеепредпочтительный сайт узнавания для Drosha, тем самым, ускоряя процессинг(Рисунок 3 с). Около 14% всех человеческих при-мкРНК содержат консервативныепетли (как у других видов), которые могут служить якорными участками дляподобной регуляции.Регулируя микропроцессорный комплекс, TGF-beta (трансформирующийфактор бета) и BMP (костный морфогенетический белок) индуцируют созреваниеmiR-21 (Рисунок 3 d). Они привлекают SMAD (лиганд-специфический передатчиксигнала) к pri-miR-21.
К SMAD присоединяется p68 (РНК-хеликаза), котораяускоряет расщепление при-мкРНК, опосредованное Drosha.Альтернативные пути созревания мкРНК включают в себя путь созреваниячерез миртроны, из эндогенных коротких шпилек РНК и из тРНК. Миртроны – этокороткиеРНК-дуплексы,содержащиесянашпилькахинтронов,ипроцессирующиеся сплайсосомой. При транскрипции получается структура лассо.В дальнейшем, она подвергается распрямлению специальными ферментами иобразует шпильку, по сути становится пре-мкРНК [152]. Малые РНК,образующиеся из шпилек РНК и тРНК видимо имеют несколько другие функции вотличии от тех, которые образовались по каноническому пути, поэтому вдальнейшем они вероятно будут определены в другой класс молекул [8].31Рисунок 3.
Пути созревания пре-мкРНК. а - малый микропроцессорный комплексрасщепляет при-мкРНК до пре-мкРНК, b -путь с участием расширенногомикропроцессорного комплекса с белками p68 и p72, с - взаимодействие pri-miR18a с hnRNP A1 и индуцирование последующего Drosha-зависимое расщепление,d – TGF-зависимый сигнальный путь, облегчающий присоединение SMAD к primiR-21, увеличение эффективности Drosha, e – альтернативный путь (черезмиртрон) [150].Процессинг мкРНК происходит в ядре, а для ингибирования трансляциимкРНК необходимо попасть в цитоплазму. Белок экспортин-5 при участии RanГТФ распознает 3’-конец пре-мкРНК (около 2-3 п.н.) и осуществляет32энергетически зависимую транспортировку пре-мкРНК через мембрану ядра вцитоплазму, где начинается второй этап созревания мкРНК [94, 153].В цитоплазме эндорибонуклеаза III – Dicer взаимодействует с 3’-концомшпильки пре-мкРНК и отрезает петлю, объединяющую 3’- и 5’- цепи.Получившийся двухцепочечный участок, длиной 22 п.н., называется мкРНКдуплексом.
Одна из цепочек этого дуплекса объединяется в эффекторный белокAGO (аргонавт), который является частью комплекса RISC (RNA induced silencingcomplex – РНК индуцирующий сайленсинг комплекс). Раньше цепочка мкРНК,которая чаще всего присоединялась к комплексу RISC называлась направляющей.В комплекс RISC также входит Dicer, РНК-связывающий белок TRBP(трансаактивационныйэлемент,ответственныйзараспознаваниевирусаиммунодефицита), SMN-комплекс (комплекс выживаемости мотонейронов), FMR1(ген ломкой X хромосомы).Вторая цепочка мкРНК – «пассажирская» или «цепочка-спутница»(обозначается«*»),деградируетсякомплексомRISC.Длядеградациипассажирской мкРНК у Caenorhabditis elegans используется фермент - Rat1p (5’-3’экзорибонуклеаза), у млекопитающих подобные ферменты описаны недостаточно.Пассажирская цепочка также может присоединяться к комплексу RISC идействовать на генную регуляцию.
Механизмы переключения между цепочкамипока не известны.Примерно 16% мкРНК на одной из стадий созревания подвергаютсямодификации [67]. Модификация может происходить как на уровне пре-, так и науровне при-мкРНК, или же затрагивать сайты зрелых мкРНК. Если регуляция идетна уровне при-мкРНК, то модификация повреждает сайт узнавания ферментаDrosha, вследствие чего отщепление петли пре-мкРНК не происходит.
Такимобразом уменьшается экспрессия мкРНК, идущих по каноническому путисозревания. При этом не затрагивается экспрессия мкРНК идущих поальтернативному пути, так как он не зависит от фермента Drosha. На уровне примкРНК идет изменение сайта узнавания фермента – Dicer. мкРНК, которые неподвергается процессингу, деградируются с помощью нуклеазы. На уровне зрелой33мкРНК их модификации вместе с изменением экспрессии играют важную роль какв физиологических, так и патофизиологических процессах.
Так увеличениеэкспрессии модифицированной miR-376a-5p при глиобластоме приводит к инвазииглиомных клеток, при этом не модифицированная мкРНК имеет противоположныесвойства и расценивается как потенциальный для мультиформной глиобластомы[69].1.2.4 Строение комплекса RISCДанный комплекс является общим звеном регуляции трансляции белков какдля мкРНК – эндогенный miRISC, так и для других малых интерферирующих РНК(миРНК) – экзогенный siRISC. Центральной функциональной единицей miRISCявляется пептидное семейство Ago, которое состоит из трех консервативных РНК– связывающих доменов: PAZ домена, который может связывать одиночные 3’концы зрелой мкРНК, PIWI домена, который взаимодействует с 5’-концомнаправляющей цепочкии MID домена, который специфически реагирует спиримидиновым кольцом (Рисунок 4).
Активный сайт PIWI домена состоит изкаталитической тетрады – D, E, D, H. Также в комплекс Ago входит N-домен,который является структурной единицей, объединяющей PAZ и PIWI домены;Helix7 – спираль, служащая для уменьшения изгибания направляющей цепочкимкРНК между шестым и седьмым основаниями.Комплекс RISC в клетках животных чаще всего присоединяется к гену вобласти 3’-UTR (3' - нетранслируемая область), тогда как в клетках растенийрегуляция генной экспрессии идет, в основном, за счет присоединения данногокомплекса в кодирующей части.34Рисунок 4. Структура AGO млекопитающих на примере hAGO2.
Оранжевая«нить» - направляющая цепочка мкРНК. Фиолетовые «гранулы» - ионы магния– Mg2+ [73].Существует несколько путей при помощи которых происходит регуляциягенной экспрессии комплексом RISC. При неполной комплементарности мкРНК кгену-мишени комплекс RISC может вызывать деаденилирование гена споследующей деградацией мРНК [39]. При этом, также может происходитьсупрессия трансляции гена при нарушении его инициализации, независимой отдеаденилирования РНК [16, 39, 41]. При полной комплементарной гибридизациимкРНК к гену-мишени (чаще всего у растений или в случае миРНК) идетдеградация мРНК при помощи специального комплекса Ago, например, Ago2 учеловека. В этом случае мРНК попадает в каталитический центр Ago, гдепроисходит ее разрезание.
Это так называемая прямая деградация мРНК. Такжепредполагается, что мкРНК может вызывать модификацию гистонов иметилирование промоторной области гена, что также влияет на экспрессиюсоответствующей мРНК [135].35мкРНК может не только угнетать, но и активировать трансляцию гена [112].мкРНКиассоциированныйснейбелковойкомплекс(мкРНП–микрорибонуклеопротеины) могут посттранскрипционно стимулировать геннуюэкспрессию как прямыми, так и косвенными механизмами [142].
Один измеханизмов заключается в следующем (Рисунок 5) [114]: маРНК (малыеактивирующие РНК), которые могут быть как мкРНК, так и миРНКприсоединяются к белку Ago, создается нуклеотид-белковый комплекс, как и вслучае ингибирования трансляции. Этот комплекс проникает в ядро клеткипассивным (при растворении клеточной ядерной мембраны во время митоза) илиактивным транспортом. Существует также теория, что маРНК попадают в ядро итам уже перепрограммируют активированный Ago-РНК комплекс.Рисунок 5.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
