Диссертация (1174327), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Однако, существует рядпроблем, которые необходимо для этого решить [40]:1) Необходимо провести больше клинических исследований экспрессиимкРНК.Нанастоящиймоментпредставленотольконесколькоисследований, большинство из которых имеют или маленькую выборкуили методологические недостатки;2) Большинство из проведенных исследований по анализу профилейэкспрессии мкРНК при инсульте выполнялось на азиатской популяции.Поэтому их результаты могут не полностью совпадать для другихэтнических групп;3) Существует большая вариативность экспрессии мкРНК внутри однойгруппы пациентов, что затрудняет определение референсных значений;4) Большинство исследований не принималивовнимание другиеклинические показатели, которые могли корректировать или дополнятьзначения экспрессии мкРНК5) Метод ПЦР в реальном времени сейчас используется как основной дляопределения экспрессии циркулирующей мкРНК. Однако, он имеет ряднедостатков, которые ограничивают его эффективное использование вклинической практики.
В частности умеренная чувствительность исложное масштабирование, которое усложняет определение несколькихдесятков мкРНК одновременно. Разработка и внедрение новых методов,таких как цифровое ПЦР и секвенирование нового покления (NGS)должны улучшить ситуацию.42ЗаключениеТаким образом, не вызывает сомнения тот факт, что ишемический инсультпредставляет собой актуальную медицинскую и крайне остро социальнуюпроблему. Хотя патогенез ИИ изучают уже давно, поэтому многие его стадии ифакторы достаточно хорошо освещены, но лежащие в их основе генетические иэпигенетическиемеханизмыдосихпоростаютсяплохоописанными.Исследование профилей экспрессии мкРНК при ИИ является перспективнымнаправлением, поскольку оно расширяет понимание базовых механизмовзаболевания, а также способствует поиску его надежных биомаркеров ипрогностических факторов. В будущем подобные знания могут также бытьиспользованы для разработки более действенной терапии.43Глава 2.
Материалы и методы2.1 Материалы исследованияИсследование проводилось в 2 этапа: как в эксперименте при моделированиифокальной ишемии у крыс, так и в клинике, у больных с ИИ. На первом этапемоделировали фокальную ишемию на лабораторных животных, а такжеопределяли экспрессию мкРНК в мозге, лейкоцитах периферической крови и вплазме. На втором этапе проводили исследование экспрессии мкРНК в плазмекрови больных с ИИ, а также у контрольной выборки.Экспериментальные исследования проводились на крысах Wistar со среднеймассой 240 г. Животных из трех выводков (n = 22) распределяли по трем группамслучайным образом так, чтобы в каждой группе были особи разных полов. Первуюгруппу (группа I) составили животные с фокальной ишемией мозга через 24 часапосле воздействия (n = 10). Во вторую группу (группа II) вошли животные сишемией мозга через 48 часов после воздействия (n = 6). Третью группу (группаIII) составили ложнооперированные животные – группа контроля (n = 6).
Образцыдля исследования отбирали следующим образом: из левого полушария мозга(ишемизированного) вырезали участок коры шириной 3–4 мм по периметрупредварительноудаленногоочага(периинфарктнаязона).Изправого(контралатерального) интактного полушария мозга вырезали такой же участоккоры (Рисунок 6). Аналогично проводили отбор образцов у ложнооперированныхкрыс. Все образцы сразу замораживали и хранили в жидком азоте.
Экспериментыс животными выполняли в соответствии с этическими принципами инормативными документами, рекомендованными Европейской конвенцией озащите позвоночных животных, используемых для экспериментов [104], а также всоответствии с “Правилами надлежащей лабораторной практики”, утвержденнымиприказом Министерства здравоохранения РФ № 199н от 01.04.2016 г.У экспериментальных животных забор периферической крови (500 мкл)проводили до и после ишемического воздействия (через 24 или 48 часов).
Образцы44цельной крови центрифугировали в течение 30 мин (при 300 х g и 4°С), собиралиплазму, а осадок использовали для получения лейкоцитов. Осадок сначалаобрабатывали лизирующим буфером (155 мM NH4Cl, 10 мM KHCO3, 1 мM EDTA),центрифугировали, затем суспендировали в фосфатно-солевом буфере (PBS) ипосле центрифугирования получали фракцию лейкоцитов. Отобранную плазмуосветляли центрифугированием при 14000 х g в течение 10 минут, и супернатантпереносили в чистые пробирки. Полученные лейкоциты и плазму замораживалипри -70°C для последующего выделения РНК.Рисунок 6.
Оценка ишемического повреждения мозга у экспериментальныхживотных. а – Макроскопическая визуализация очага в левом полушарии исоответствующего участка в правом контралатеральном полушарии (участкивыделены квадратами). б – Магниторезонансная томография (МРТ) головногомозга крысы с видимым очагом ишемического повреждения (светлая зона) влевом полушарии.Клинические исследования были проведены на 10 больных с ишемическиминсультом. У всех пациентов собирался анамнез и проводился КТ или МРТ анализголовного мозга для постановки точного диагноза, а также для определения объемапоражения.
Критериями исключения были геморрагический инсульт и острыеинфекционные заболевания. У пациентов до взятия крови оценивали тяжестьинсульта по шкале NIHSS (National Institutes of Health Stroke Scale) [105]. Этобалльный показатель неврологических расстройств, где 0 баллов считается как их45отсутствие, а 42 – максимально негативный результат. В контрольную группусравнения входили 10 волонтеров без хронической ишемической болезни сердца иинсульта в анамнезе, подобранных в соответствии с возрастом и полом группыбольных. Кровь для получения плазмы (2-5 мл) брали у пациентов на первые (непозднее 16 часов) и восьмые сутки после инсульта и однократно у контрольнойвыборки.
Образцы крови сразу центрифугировали при +4 °С 300 х g в течение 20минут, отбирали супернатант, который снова центрифугировали при +4°С 15000 хg в течение 15 минут. После второго центрифугирования супернатант – очищеннуюплазму, хранили в кельвинаторе при -80 °С до выделения РНК. Проведенныеклинические исследования были одобрены в этическом комитете ФГАОУ ВОПервый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России; все пациенты и волонтерыбыли ознакомлены с целями исследования и подписали соответствующееинформационное согласие.2.2 Методы исследования2.2.1 Метод фотохимически индуцированного тромбозаОдносторонний фокальный ишемический инфаркт сенсомоторной областикоры головного мозга крыс создавали методом фотохимически индуцированноготромбоза согласно методике, описанной Ватсоном с соавторами [146].Операцию проводили под общим наркозом (хлоралгидрат 300 мг/кг,внутрибрюшинно) и с поддержанием постоянной температуры тела 37 oC.
Затемкрысам вводили фотосенсибилизируемый краситель бенгальский розовый (40мг/кг, внутривенно), фиксировали на стереотаксисе, делали продольный разрезкожи и удаляли надкостницу. Для облучения использовали специальнуюустановку, состоящую из источника холодного света с галогеновой лампоймощностью 250Вт, теплопоглощающего и фильтрующего (максимум пропускания- 560нм) фильтров, и световода с диаметром внутреннего сечения 3мм.
Световодустанавливали на расстоянии 1мм от поверхности левой лобной кости черепа надсенсомоторной областью коры левого полушария мозга: на 0,5мм ростральнее46брегмы и на 3,7мм латеральнее сагиттального шва. Затем проводили облучение втечение 15 минут. Ложнооперированные животные подвергались тем жепроцедурам, за исключением этапа введения фотосенсибилизируемого красителя.После выхода из наркоза крыс возвращали в клетки.Через 24 и 48 часов крыс декапитировали, извлекали мозг, промывали вфизиологическом растворе.
Образцы биоптатов коры мозга (сенсомоторнаяобласть) крыс отбирали из зоны пенумбра поврежденного(левого) иконтралатерального (неповрежденного) правого полушария коры мозга.2.2.2 Выделение тотальной РНК и мкРНК из полученных образцов ткани,крови и плазмыОбразцытканикорыголовногомозгакрыспредварительногомогенизировали с лизирующим буфером. Выделение тотальной РНК проводилис использованием набора miRNeasy Micro Kit (QIAGEN, Германия) на прибореQIAcube в соответствии с инструкцией фирмы-производителя [116].
ИзмерениеконцентрацииичистотыполученнойтотальнойРНКпроводилосьнаспектрофотометре NanoVue Plus (GE Healthcare). Соотношение значенийпоглощения света (A) при длинах волн 260 нм и 280 нм (A260/A280) для РНКнаходилось в пределах 2, а A260/A230 - в пределах 2,2.Необходимо отметить, что после выделения РНК всегда присутствуетнекоторая доля примесей, которые ингибируют последующие ПЦР и ОТ-ПЦР,поэтому для дополнительной очистки и концентрирования низкомолекулярнойфракции РНК (таких как мкРНК и мяРНК – малые ядерные РНК) использовалинабор RNeasy MinElute Cleanup Kit (QIAGEN, Германия) в соответствии синструкцией фирмы-производителя [115].
Элюция осуществлялась в 15 мкл водыбез РНКаз. В среднем концентрация РНК была в пределах 1000 нг/мкл.Выделение мкРНК из плазмы (400 мкл) проводили при помощи набораmiRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen, Германия) согласно рекомендациямпроизводителя.
При выделении мкРНК после этапа денатурации добавляли 7 мкл47cel-miR-39 (рабочая концентрация 1,6 x 108 копий/мкл) в качестве экзогенногоконтроля. Элюция осуществлялась в 10 мкл воды без РНКаз. В среднемконцентрация мкРНК была в пределах 10-15 нг/мкл.2.2.3 Критерии выбора мкРНК и генов для исследования, составлениятаблиц и баз данныхСписок мкРНК для исследования был сформирован с использованиемспециальных баз данных miRWalk v.2.0 и miRBase, а также на основании анализалитературных источников по генам-мишеням и мкРНК, вовлеченным в апоптоз,нейрогенез, нейропротекцию, реакции воспаления и процесс транскрипции [35,46].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
