Диссертация (1174327), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Установлено, что убольных с ишемическим инсультом, как на первые, так и на восьмые сутки,медиана отношений экспрессий исследуемых мкРНК уменьшалась по сравнению сконтрольной выборкой (КИ = 1,72). На первые сутки у всех больных по сравнениюс контролем достоверно уменьшалась экспрессия let-7i-3p и miR-23a-3p, а навосьмые сутки miR-22-5p (Таблица 9). Экспрессии let-7i-3p и miR-22-3p также былистатистически значимо повышены у пациентов на восьмые сутки после ишемии, посравнению с первыми сутками.70Таблица 9. Изменения в уровнях экспрессии мкРНК в плазме крови пациентовна первые и восьмые сутки после ишемического инсульта и контроля.ПациентыПациенты сПациенты сppс ИИ на 8ИИ на 1-ыеИИ на 8-ыеp (Уил(Манн(Манн- ые сутки/мкРНКсутки/ лицасутки/ лицакоксонУитниУитни пациентыконтрольнойконтрольнойтест)тест)тест)на 1-ыевыборки, КИвыборки, КИсутки, КИlet-7i-3p0,0100,0240,4230,20940,4950,018miR-223p0,1410,0640,4490,5283,1800,028miR-225p0,3471,0000,1080,0190,3110,655miR-23a3p0,7140,0160,3870,0830,5410,674Примечание - Курсивом в таблице обозначены полученные значенияотносительной экспрессии статистическая значимость которых меньше 0,05(p<0,05).Экспрессия let-7i-3p была достоверно ниже на первые сутки у группы 2 посравнению с группой 1 и контрольной выборкой.
Её экспрессия достоверноувеличивалась более чем в 14 раз во второй группе пациентов на восьмые сутки посравнению с первыми сутками (Рисунок 12 A). С другой стороны, была обнаруженалишь тенденция к достоверности в экспрессии let-7i-3p на восьмые сутки междупервой и второй группой больных (p = 0,052).
Другой мкРНК, экспрессия которойдостоверно увеличивалась во второй группе на восьмые сутки по сравнению спервыми была miR-92b-3p (Рисунок 12 В).Экспрессия miR-23a-3p у второй группы больных на первые сутки послеинсульта была статистически достоверно ниже, чем у контрольной выборки в 1,4раза (Рисунок 12 Б).мкРНК miR-22-5p не была обнаружена ни у одного из пациентов второйгруппынапервыесутки,поэтомуневозможноформальнопосчитатьстатистическую значимость отличия в экспрессии данной мкРНК между группами.На восьмые сутки у второй группы пациентов экспрессия данной мкРНК71увеличилась и ее можно было детектировать, хотя и значение экспрессии былониже, чем у контрольной выборки в 13 раз (Рисунок 12 Г).Еще одной дифференциально экспрессирующейся мкРНК была miR-99a-5p.Ее экспрессия на первые сутки в первой группе пациентов была статистическизначимо выше по сравнению со второй группой, а также контрольной выборкой.Однако, уже на восьмые сутки экспрессия данной мкРНК уменьшилась и сталасоответствовать значению в остальных группах.Близкими к статистическим были также отличия в экспрессии miR-223-3pмежду первой группой больных на первые сутки и контрольной выборкой (КИ =0,32, p = 0,058).
При этом экспрессия данной мкРНК в плазме второй группыпациентов не изменялась.Для оценки диагностической значимости экспрессии let-7i-3p и miR-23a-3pкак потенциальных биомаркеров инсульта, был проведен анализ ROC кривых ипоследующее вычисление площади под кривой (AUC). Как видно на рисунке 13,кривые для let-7i-3p (Рисунок 13 А) и miR-23a-3p (Рисунок 13 Б) показываютхорошее разделение между пациентами с инсультом и контрольной выборкой сAUC равной 86,7% (95% доверительный интервал (ДИ): 64.1–100 %) и 79,9% (95%ДИ:57,7–100%)соответственно.Оптимальнойточкойотсечениядлянормированной экспрессии let-7i-3p было 0,4х104 с чувствительностью 66,7% испецифичностью 100%; для miR-23a-3p - 11,2х104 с чувствительностью 81,2% испецифичностью 88,9%.72Рисунок 12.
Уровни нормированной на cel-miR-39 экспрессии мкРНК let-7i-3p(A), miR-23a-3p (Б), miR-92b-3p (В) и miR-22-5p (Г) у двух групп пациентов синсультом: группы 1 (пациенты с увеличением показателя по шкале NIHSS на8-е сутки) и группы 2 (пациенты с уменьшением показателя по шкале NIHSSна 8-е сутки) на первый и на восьмой день после ишемического инсульта и угруппы контроля. Данные представлены в виде медианы и квартилей.
Точкойобозначены выбросы – значения, которые больше 3го квартиля или меньше 1гона 1,5хИКР; где ИКР – расстояние между 1м и 3м квартилем. * - p < 0,05, длясвязанных выборок – по критерию Уилкоксона, для несвязаннаых – по Uкритерию Манна-Уитни.73А)Б)Рисунок 13. ROC кривая для оценки экспрессии let-7i-3p (А) и miR-23a-3p (Б).AUC для let-7i-3p и miR-23a-3p были 86,7% и 79,9% соответственно.Было проведено сравнение экспрессии мкРНК в плазме крови больныхинсультом и контрольной выборки в зависимости от пола.
Было обнаружено, чтоlet-7i-5p (Рисунок 14 A) и miR-92b-3p (Рисунок 14 Б) имеют пониженнуюэкспрессию в крови женщин даже в норме, по сравнению с мужчинами (в 4 и 3 разасоответственно, р<0,05). Также, значения экспрессии этих мкРНК были ниже упациентов мужчин на первые сутки по сравнению с контролем в 2,5 раза у let-7i-5pи в 1,6 раза у miR-92b-3p.
У пациентов женщин экспрессия miR-92b-3p была вышена восьмые сутки в 4,7 раза по сравнению с контрольной выборкой.74Рисунок 14. Уровни нормированной на cel-miR-39 экспрессии мкРНК let-7i-5p(A) и miR-92b-3p (Б) у женщин и мужчин пациентов на первые и на восьмыесутки после ишемического инсульта и у группы контроля. Данныепредставлены в виде медианы и квартилей. Точкой обозначены выбросы –значения, которые больше 3го квартиля или меньше 1го на 1,5хИКР; где ИКР –расстояние между 1м и 3м квартилем.
* - p < 0,05, ** - p < 0,01 для связанныхвыборок – по критерию Уилкоксона, для несвязаннаых – по U критерию МаннаУитни.Также как и в случае экспериментальных животных, в плазме крови больныхбыла проанализирована корреляция значений экспресии «пассажирской» и«ведущей» цепочки мкРНК. Однако, значения получились во многом отличнымиот тех, что были обнаружены в крови и в мозге крыс. Так на первые сутки послеинсульта экспрессия обоих цепочек let-7i и miR-99a достоверно коррелировалимежду собой (ρ = 0,692 и 0,742 соответственно), но уже на восьмые суткикорреляция пропадала. При этом появлялась зависимость между экспрессиямидругих мкРНК: miR-27a (ρ = 0,831) и mir-30a (ρ = -0,686).
Важно отметить, чтокорреляция между значениями экспресии «пассажирской» и «ведущей» цепочкиmir-30a также была отрицательной у пациентов на первые сутки после инсульта иу группы контроля (в обоих случая без статистической значимости). Схожиерезультаты были обнаружены и в лейкоцитах крови крыс на первые и на вторые75сутки после фотохимическииндуцированного тромбоза (также статистически недостоверно).76Глава 4. Обсуждение4.1 Обсуждение общих результатов исследованияВ последнее время увеличивается количество исследований, посвященныхроли мкРНК как ключевых регуляторов процессов, происходящих в головноммозге в ответ на патологическое состояние, например, ишемическое повреждение[32, 50, 65, 87, 127]. Большинство работ являются экспериментальными, гдепредметом исследования являются лабораторные животные (в основном крысы) иреже клеточные культуры [154]. Биологическими материалами для экспериментовслужат как биоптаты мозга животных, так и кровь [61], и даже ликвор [129].
Естьэксперименты, которые посвящены исследованию функций отдельных мкРНК(например, miR-29b-3p [145]) и только единицы работ, где анализируются более 10мкРНК [61].Кроме исследований на лабораторных животных и клеточных культурахсуществует несколько работ, посвященных изучению экспрессии мкРНК впереферической крови или плазме больных инсультом [63, 162].Однако, многое еще не изучено.
До сих пор детально не исследованывременные паттерны экспрессии мкРНК, участвующих в патогенезе ишемии,непосредственно в лейкоцитах. Пока собрано небольшое количество данных обэкспрессии мкРНК в периферической крови больных инсультом. Кроме того, почтинет исследований, которые объединяли бы экспериментальные и клиническиеподходы к изучению данной проблемы.В данной работе применен комплексный подход к решению вопроса ролимкРНК в патогенезе и исходе ишемического инсульта: проведено исследование какна лабораторных животных, так и на клинических образцах (плазма крови больныхсинсультом).Впервойчастиэкспериментаиспользовалимодельфототромботического «кольцевого» инсульта с поздней спонтанной реперфузиейи восстановлением тканей, которая позволяет получить воспроизводимый объемишемического очага.
Кроме того, в этой модели ишемии происходит агрегация77тромбоцитов [146], стимулируется ангиогенез и нейрогенез [26, 27]. Посколькувосприимчивость к гипоксии различных типов клеток в головном мозге неодинаково, их повреждение определяется тяжестью и продолжительностьюишемическоговоздействия.Какследствие,максимальнаяконцентрацияапоптотических клеток в плотных ишемизированных участках наблюдается черезсутки и сохраняется до трех суток. В тоже время некротические клетки можновыявить не ранее через двое суток после ишемии [59].
Следует отметить, чтоработы по оценке экспрессии мкРНК с использованием подобной модели ранее непроводились.Профиль экспрессии мкРНК в лейкоцитах крови крыс, подвергнутыхфотоиндуцируемой ишемии, показывает, что в исследуемых временных точках (24и 48 часов) экспрессия более половины из 45-ти выбранных мкРНК изменяется от1,5 до 9 раз по сравнению с контрольной выборкой.
Изменения в экспрессии однихмкРНК наблюдались либо через 24 часа, либо через 48 часов, а для другихвыявляется тенденция к повышению экспрессии с 24 до 48 часов. Эти результатысогласуются с данными по кинетике накопления лейкоцитов и экспрессии геновмедиаторов воспаления в ишемизированной ткани мозга – их максимальныезначения приходятся на тот же временной интервал [3, 17].Недавно было показано, что в зависимости от степени и продолжительностивоспалительногостимула,мкРНКэндотелиальныхклетокмозгамогутрегулировать экспрессию генов (чтобы препятствовать цитокиновым сигналам)для поддержания состояния покоя, или, наоборот, способствовать экспрессииопределенных генов, активирующих эндотелий, что, в конечном итоге, приводит кнарушению проницаемости гематоэнцефалического барьера [91].
Цитокины, всвою очередь, регулируют экспрессию мкРНК эндотелиоцитов, которые либоактивируют, либо ингибируют реакции воспаления. Учитывая, что инфильтрациялейкоцитов в ишемизированной области способствует активации эндотелиальныхклеток, микроглии/макрофагов и астроцитов (наряду с иммунными клетками) истимулирует выработку и высвобождение провоспалительных цитокинов, мы78предположили, что все эти процессы могут регулироваться мкРНК, экспрессиякоторых изменяется при ишемии и в ткани мозга, и в лейкоцитах крови.По нашей информации, в этом исследовании было впервые выявлено, что посравнениюсложнооперированными(контрольными)животнымиуровниэксрессии мкРНК изменяются не только в ишемизированном полушарие, но и винтактном.
Среди мкРНК c достоверно увеличенным уровнем экспрессии вишемизированном полушарии более чем в 2 раза определены следующие: let-7f-5p,miR-9a-5p, miR-21-5p, miR-22-5p, miR-23a-3p, miR-24-3p, miR-26a-5p, miR-27a-5p,miR-27b-3p, miR-29a-5p, miR-30a-3p, miR-30c-5p, miR-99a-3p, miR-99a-5p, miR128-3p, miR-186-5p, miR-221-3p, miR-223-3p и miR-376b-5p. Также важно отметить,что, как видно из Рисунка 8, при помощи значений экспрессии выбранных мкРНКв левом (ишемизированном) полушарии можно достаточно точно разделить крыспо группам: крысы с ишемией через 24 часа, с ишемией через 48 часов иложнооперированные.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
