Диссертация (1174246), страница 7
Текст из файла (страница 7)
В комбинации с моликсаном – гепатопротектором с пептиднымкомпонентом семакс уменьшал степень тяжести алкогольного отравления и снижал количество крыс в терминальной коме в 2,5 раза, увеличивал выживаемостькрыс на 66% при использовании 1,5 ЛД50 этанола, а при использовании 2ЛД50 этанола увеличивал среднюю продолжительность жизни погибших животных в 7,8раза [126]. При этом наблюдалось уменьшение интенсивности и распространенности жировой и белковой дистрофии печени, снижалось количество фокальныхнекрозов и некробиозов, снижалась выраженность стромально-клеточных реакций в паренхиме печени [72].При внутрибрюшинном введении в дозах 1,5, 15, 50, 500 и 1500 мкг/кг семакс оказывал анальгетический эффект, увеличивая болевой порог [21, 78, 112].Антиноцицептивный эффект семакса возрастал с увеличением дозы препарата идостигал максимума в дозах 500 и 1500 мкг/кг на фоне одновременного уменьше-34ния времени наступления эффекта, но интраназальное введение пептида в дозах50 и 500 мкг/кг не изменяло болевого порога у крыс [78].Эффекты семакса могут быть также опосредованы влиянием на опиоиднуюсистему организма путем снижения скорости расщепления эндогенных опиоидных пептидов ферментами [51].
На фоне блокады опиоидных рецепторов анальгетический эффект, вызванный внутрибрюшинным введением семакса, значительноуменьшался и полностью исчезал при блокаде серотониновых рецепторов [53].Под действием АКТГ4-7-ПГП наблюдается активация серотонинергическойи дофаминергической системы мозга [238] и увеличение содержания норадреналина в гипоталамусе крыс [11]. Данные субстанции являются медиаторами нисходящих цереброспинальных антиноцицептивных импульсов, а эндогенные опиоиды служат медиаторами серотонинергических и норадреналинергических нисходящих спинальных путей [189]. Активируя данные системы, семакс оказываетанальгетическое действие [53].Влияние препарата на болевую чувствительность может быть обусловленокак прямым его взаимодействием с глутаматергической системой мозга, так иопосредованным влиянием через экспрессию нейротрофинов [165].
Как известно,значительная роль в преобразовании ноцицептивных сигналов принадлежит глутаматергическим синапсам первичных афферентных нейронов спинальных ганглиев, осуществляющих передачу сенсорных сигналов с периферии в спинноймозг, а также вторичным аферентным нейронам дорсального рога, которые интегрируют болевой сигнал и передают его в восходящем направлении. Во многихотделах мозга функционирование глутаматной передачи нейроимпульса связано свыбросом нейротрофинов, рецепторы которых (trkA, trkB) широко экспрессируются в глутаматных синапсах.Таким образом, семакс обладает широким спектром физиологических ифармакологических эффектов, позволяющим рассматривать его как перспективный препарат для коррекции стрессиндуцированных изменений в печени при различных видах стрессорных воздействий.35Глава 2.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯДля изучения эффектов АКТГ4-7-ПГП (семакса) и направленности его влияния на структуру и функции гепатоцитов при эмоционально-болевом и иммобилизационном стрессе был выполнен ряд биохимических и морфологических исследований, включавший в себя изучение:1)биохимических показателей сыворотки крови, характеризующихфункциональное состояние гепатоцитов;2)показателей антиоксидантной системы и перекисного окисления ли-пидов в гомогенате печени;3)морфологических характеристик печени у интактных и эксперимен-тальных животных.2.1. Экспериментальные животныеЭксперименты выполнены на 216 половозрелых крысах-самцах линии Вистар массой 200-350 г, полученных из питомника РАМН «Столбовая», прошедших карантинный режим вивария Курского государственного медицинского университета.
Для контрольных и опытных групп каждой экспериментальной сериииспользовались животные, полученные из питомника одновременно.Животные содержались в стандартных условиях, в пластиковых клетках,при температуре воздуха в помещении 22±2°С и относительной влажности 3050%. Световой режим – 12 часов – свет, 12 часов – темнота.
Животные получали всвободном доступе стандартный гранулированный корм и воду.Все исследования были выполнены с соблюдением принципов Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным 1975 г. в редакции 2008 г.,«Руководства по проведению доклинических исследований лекарственныхсредств» (Москва, 2012), Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997 г.) и в соответствии с решением регионального этического комитета362.2. ПрепаратВ работе использовали фрагмент N-терминального конца АКТГ Met-GluHis-Phe-Pro-Gly-Pro (АКТГ4-7-ПГП), синтезированный в Институте молекулярной генетики РАН.Присоединение трипептида пролил-глицил-пролина к природному фрагменту АКТГ4-7 увеличило устойчивость препарата к протеолитическому действию протеаз и, таким образом, пролонгировало его действие [30, 79].Пептид растворяли в изотоническом растворе хлорида натрия и вводиливнутрибрюшинно за 12-15 минут до начала стрессорного воздействия в дозах 5,50, 150 и 450 мкг на 1 кг массы тела.Контрольные стрессированные животные получали внутрибрюшинныеинъекции физиологического раствора в эквивалентном объеме (0,1 мл на 100 гмассы тела) в аналогичное время.
Интактным животным, не подвергавшимсястрессированию, вводили эквивалентные объемы физиологического раствора.Использованные в экспериментальных сериях дозы пептида выбраны с учетом литературных данных об установленных эффективных дозах препарата [78,79].2.3. Моделирование острого и хронического эмоционально-болевого стрессаПри моделировании эмоционально-болевого стресса использовалась модификация методик D. Hranilovic [182] и D. B. Matthews [131].
Острый эмоционально-болевой стресс (ОЭБС) создавали однократным электрокожным раздражением лап попарно сгруппированных животных в камере с металлическим электрифицированным полом. С помощью программируемого электростимулятора напол камеры в течение 30 минут подавались импульсы тока силой 0,1-0,2 mА продолжительностью 5 секунд с межимпульсным интервалом 15 секунд, после чегоживотные сразу выводились из эксперимента.
При моделировании хроническогоэмоционально-болевого (ХЭБС) стресса аналогичное воздействие осуществлялосьв течение 5 дней подряд в одно и то же время, в первой половине дня.372.4. Моделирование острого и хронического иммобилизационногострессаИммобилизационный стресс моделировался с применением модификацииметодик H.
Chen et al. [144], J. Zheng et al. [166] и S.W. Wang [260]. Животные помещались в индивидуальные пластиковые боксы, соответствующие размерам животного. Животных фиксировали в положении на спине. Контроль дыхания осуществляли визуально.При моделировании острого иммобилизационного стресса (ОИС) времяэкспозиции животных составляло 4 часа однократно, хронического (ХИС) – по 2часа в течение 5 дней. После завершения экспериментального воздействия животные сразу выводились из эксперимента.
Эксперименты проводились в одно и тоже время в первой половине дня.2.5. Выведение животных из эксперимента и забор биологическогоматериалаЖивотные выводились из эксперимента под наркозом путем обескровливания. Забор крови осуществлялся из правого желудочка сердца с использованиемзакрытых систем для взятия крови S-Monovette® с активатором свертывания дляполучения сыворотки производства SARSTEDT (Германия). Затем пробирки сосвернувшейся кровью подвергались центрифугированию в течение 10 минут соскоростью 1500 об./мин. Полученная сыворотка разливалась в промаркированныепробирки Эппендорфа емкостью 0,5 мл и замораживалась при температуре -20° Сдля определения биохимических показателей крови.Для изучения показателей ПОЛ и системы антиоксидантной защиты гепатоцитов сразу после забоя животного производился забор части печени.
Печеньвзвешивали, помещали в десятикратный объем (масса ткани/объем раствора) ледяного физиологического раствора и гомогенизировали. Образовавшийся гомогенат центрифугировался в течение 10 минут при скорости 3000 об./мин, полученный супернатант замораживался при температуре -20°С.38Размораживание проб биологического материала проводилось на водянойбане при температуре 37°С, повторное замораживание не допускалось.2.6.
Исследование показателей биохимического анализа сывороткикрови, характеризующих функциональное состояние печениДля оценки протеинсинтетической функции гепатоцитов использовали измерение концентрации общего белка в сыворотке крови, детоксикационной функции – мочевины, проводимое на автоматическом биохимическом анализаторе«Виталаб Флексор Е» (Нидерланды) с использованием реагентов Analyticon (Германия) биуретовым методом при длине волны 570 нм [67].Степень выраженности процессов цитолиза оценивалась путем определенияактивности аминотрансфераз: аспартатаминотрансферазы (АсАТ) и аланинаминотрансферазы (АлАТ), холестатических процессов – путем определения активности щелочной фосфатазы (ЩФ) на автоматическом биохимическом анализаторе«Виталаб Флексор Е» (Нидерланды) с использованием реагентов Analyticon (Германия) кинетическим методом при длине волны 340 нм.2.7.
Исследование показателей системы перекисного окисления липидови системы антиоксидантной защитыИнтенсивность процессов перекисного окисления липидов в гомогенате печени определялась по содержанию малонового диальдегида (МДА), состояниемеханизмов антиоксидантной защиты – путем исследования активности ферментов: каталазы и супероксиддисмутазы (СОД), а также интегрального показателя –общей антиокислительной активности (ОАА).Определение продукта перекисного окисления липидов – малоновогодиальдегида (МДА) производили спектрофотометрически с использованием спектрофотометра «Apel 330 PD» (Япония) после экстракции бутанолом с помощьюнаборов «ТБК-Агат».
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
