Диссертация (1174214), страница 20

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 20)

Об АО говорили при ОТ > 88 см уженщин и >102 см у мужчин [309].Объективный осмотр, включающий оценку уровня АД (мм.рт.ст.) иЧСС (уд/мин). Уровень АД измерялся на обеих руках после 10-минутного отдыха вположении сидя 3 раза с интервалом в 2 мин. на калиброванном приборе сиспользованием плечевой манжеты (HEM-7200 M3,OmronHealthcare, Kyoto, Japan).В анализ включали среднее из 3 измерений. Повышенным считалось АД >140/90мм.рт.ст. При регистрации повышения АД впервые в жизни назначался повторныйвизит через месяц.

Диагноз АГ ставился по результатам измерения АД в ходе неменее чем двух визитов. При подозрении на гипертонию «белого халата»назначалось внеофисное измерение АД (в домашних условиях 2 раза с интерваломне менее 1 мин утром с 6.00 до 9.00 и вечером с 18.00 до 21.00) ежедневно в течение7 дней [17]. АГ диагностировалась при повышении уровня АД ≥135/85 мм рт. ст.при измерении в домашних условиях [10].108Регистрация электрокардиограммы в 12 отведениях проводилась наэлектрокардиографе Cardiovit at-10 plus, Schiller (Швейцария).Проба с физической нагрузкой (тредмил-тест по протоколу Bruce) дляисключения преходящей ишемии миокарда выполнялась на приборе Intertrack,Schiller (Швейцария).Трансторакальная эхокардиография для исключения ишемическойболезни сердца, кардиомиопатий, пороков сердца проводилась по стандартнойметодике на приборе Philips ie 33 (Нидерланды).После установления соответствия критериям включения, исключения,подписания информированного согласия пациент включался в исследование.Пациенты набирались в двевозрастные группы.

В младшую группу быливключены мужчины до 45 лет, женщины до 55 лет включительно, люди старшеэтого возраста составили старшую группу. Такое деление было связано с тем, чтовозраст старше 45 лет для мужчин и старше 55 лет для женщин считается ФР ССЗ[309]. При выявлении критериев исключения обследуемый исключался изисследования на любом этапе. Включенным в исследование пациентампроводились основные методы исследования.2.3. Основные методы исследования2.3.1. Лабораторные методы исследованияЛабораторные исследования выполнялись на базе лаборатории ФГБУ НМИЦПМ Минздрава России. С 9:00 до 10:00 в процедурном кабинете всем пациентамсистемой BD Vacutainer® из кубитальной вены проводился забор венозной крови.Процедура осуществлялась в состоянии покоя, после 30-минутного отдыха, вположении сидя.

Перед процедурой пациентам запрещалось курить и приниматьпищу в течение 12 часов.Набор исследований включал:Общеклинический анализ крови по стандартной методике109Измерение ОХС, ТГ и ХСЛВП определяли ферментативнымфотометрическим методом. Содержание ХСЛНП вычисляли по формулеФридвальда: ХСЛНП = ОХС – (ТГ/2,2 + ХСЛВП). Нормальные значения для ОХС<5,0 ммоль/л, для ХС ЛПНП < 3,0 ммоль/л.

Сниженным считался уровень ХСЛПВП < 1,2 ммоль/л у женщин, < 1,0 ммоль/л у мужчин. ГТГ определялась приуровне ТГ > 1,7 ммоль/л. [16].ОпределениепроводилосьЛп(а),иммунотурбодиметрическимапоА1,апоВметодом. Референсные значенияЛп(а): 0 - 0,3 г/л; апоА1: для женщин 1,08 - 2,25 г/л, для мужчин 1,04 - 2,02 г/л;апоВ: для женщин 0,6 - 1,17 г/л, для мужчин - 0,66 - 1,33 г/лОпределениеуровняглюкозыплазмынатощак(ГН)глюкозооксидазным методом. Нормальные значения - 3,9 - 6,0 ммоль/л.ГГЛ диагностировалась при ГН ≥ 6.1 ммоль/л.Определениеиммунореактивногоинсулина(ИРИ)методомхемилюминесценции. Референсные значения ИРИ – 2-25 мкЕд/мл.

Расчет индексаинсулинорезистентности НОМА (Homeostasis Model Assessment of InsulinResistance) проводился по формуле: [Концентрация глюкозы в крови натощак(ммоль/л)] х [Концентрация инсулина в крови натощак(мкЕД/л)]/22.5. При индексеНОМА > 2,5 диагностировалась ИР [475].Лицам с ФР развития СД 2 (АО, возраст > 45 лет, наличие АГ,семейный анамнез СД, гестационный СД анамнезе), а также при уровне ГН = 6,16,9 ммоль/л проводился оральный глюкозотолерантный тест (ОГТТ).

После заборакрови натощак больные принимали внутрь 75 г безводной глюкозы, раствореннойв 300 мл воды. Через 2 часа производился повторный забор крови. В периодпроведения теста исключалось курение, прием пищи и физические нагрузки.Нарушенной толерантностью к глюкозе (НТГ) считалось состояние, при которомуровень постпрандиальной глюкозы через 2 часа после ОГТТ (Г2Ч) был ≥ 7,8ммоль/л и < 11,1 ммоль/л [1].Определение уровня гликированного гемоглобина (НbА1с) методомжидкостной хроматографии.

Повышенными считались значения >6,5%.110Диагноз СД2 устанавливался: 1) при уровне ГН ≥ 7 ммоль/л или уровне Г2Ч≥ 11,1 ммоль/л; 2) при уровне НbА1с ≥ 6,5 ммоль/л [1].Определениекреатининавсывороткекинетическимметодом(модификация Яффе). Референсные значения - 80-115 мкмоль/л для мужчин, 53-97мкмоль/л для женщин. Расчет СКФ проводился по формуле CKD-EPI. Для мужчин:СКФ = 141×min (креaтинин крови (мг/дл)/0,9 или 1)-0,411 × max (креaтинин крови(мг/дл)/0,9или1)-1,209×0,993ВозрастДля женщин: СКФ = 144×min (креaтинин крови (мг/дл)/0,7 или 1)-0,329 × max(креaтинин крови (мг/дл) /0,7 или 1)-1,209 × 0,993Возраст [401].Определение уровня мочевины в сыворотке УФ-кинетическимуреазным-глутаматдегидрогеназным методом. Референсные значения – 2,4-8,3ммоль/л.Оценка выраженности XBB проводилась путем определения уровня С-РБ иммунотурбодиметрическим методом, ФБГ методом детекции боковогосветорассеивания,определенияпроцентапоконечнойточке,ИЛ-6электрохемилюминисцентным методом.

Референсные значения: С-РБ 0,3-5,0 мг/л,ФБГ 2-4 г/л, ИЛ-6 <10 пг/мл.Малоновыйдиальдегид(МДА)определялсяфотометрическимметодом. Референсные значения:2,2-4,8 мкмоль/л.ОпределениеФВБпроводилоськоагулометрическимметодом.Повышенными считались значения > 150%.Определениегомоцистеинапроводилосьиммунохемилю-минисцентным методом. Референсные значения: для женщин 5 - 12 мкмоль/л, длямужчин 5 - 15 мкмоль/л.Оценка активности РААС осуществлялась путем определенияактивности альдостерона с помощью иммуноферментного анализа, АРП всыворотке крови иммунохемилюминисцентным методом, расчет их соотношения.Повышенным считалась АРП >1,9 нг/мл/час, уровень альдостерона >355 пг/мл,соотношение Альдостерон/АРП >30,0.111Уровни СТГ и ТТГ определялись иммунохемилюминисцентнымметодом, ИПФР-1 и кортизола с помощью твердофазного хемилюминесцентногоиммуноферментного анализа.

Повышенными считались следующие значения: СТГ> 10 нг/мл, ИПФР-1 > 307 нг/мл, ТТГ > 4,2 МкЕ/мл, кортизол > 535 нмоль/л.Уровеньальбуминавсуточноймочеопределялсяиммунотурбодиметрическим методом. При значениях > 30 мг/л говорили об АУ.УровеньNT-proBNPэтилендиаминтетраацетатом.определялиМетодвплазмеопределения:кровисдвухступенчатыйхемилюминесцентный иммуноанализ на парамагнитных микрочастицах с гибкимипротоколами анализа Chemiflex. Единицы измерения – пг/мл. Референсныезначения:0-125 пг/мл.2.3.2. Определение длины теломер лейкоцитовДлина теломер определялась в лейкоцитах крови.

Анализ проводился нагеномной ДНК. В ходе анализа методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) вреальномвремениоценивалоськоличествоДНКстеломернойпоследовательностью в геноме. Параллельно проводилась ПЦР в реальномвремени к однокопийному участку геномной ДНК. Отношение количествтеломернойиоднокопийнойматрицпропорциональнодлинетеломер.Одновременно с одними реактивами за исключением праймеров готовилисьстоковые смеси 1,25x (1x смесь: буфер для ПЦР 1x (Fermentas 10х PCR Hotstart buf+KCl), MgCl2 2 мМ, dNTP 0.2 мМ, 0.25 пмоль/мкл каждого праймера, 0,05 ед/мклполимеразы Maxima (Fermentas), Sybr Green I 0.2x). Для теломерной ПЦРиспользовалась пара праймеров Tel1 ggtttttgagggtgagggtgagggtgagggtgagggt и Tel2tcccgactatccctatccctatccctatccctatcccta.

Для контрольной ПЦР использовалась парапраймеров 36B4u cagcaagtgggaaggtgtaatcc и 36B4d cccattctatcatcaacgggtacaa. Смесиаликвотились в 96-луночных планшетах по 16 мкл и к ним приливалось 4 мклраствора анализируемой геномной ДНК с концентрацией 10 нг/мкл. Образцысмешивались, центрифугировались и амплифицировались в амплификаторе112CFX96. Схема амплификации для теломерного ПЦР 95C 5 минут, затем 35 циклов95С 20 сек, 54С 2 мин, затем плавление. Схема амплификации для контрольнойПЦР 95C5 минут, затем 35 циклов 95С 20 сек, 58С 1 мин, затем плавление.При амплификации соответствующие теломерные и контрольные смеси занимаютодни ячейки прибора.

Для каждого образца делалось три повторности теломернойреакции и три повторности контрольной реакции. Рассчитывалась разница цикловпорогов амплификации теломер и однокопийного гена и из них - относительноезначение длин теломер. В качестве реперной точки использовалась геномная ДНКиз клеточной линии HEK. Такой анализ является простым, быстрым и обладаетбольшой пропускной способностью. Единица измерения – условные единицы[155].2.3.3. Анализ активности теломеразыПроводился на чисто выделенной моноцитарной фракции клеток крови(примесь эритроцитов мешает анализу), 10000 клеток на анализ.

Клетки моноцитовлизировались буфером с мягким детергентом, отделялся экстракт. Для этогоклетки, полученные из моноцитарного кольца на градиенте плотности Ficoll ипромытые буфером PBS, ресуспендировались в лизирующем буфере (10 мМ TrisHCl или 10мМ HEPES-KOH, рН 7.5, 1.0 мМ MgCl2, 1 мМ EGTA, 5 мМмеркаптоэтанол, 5% глицерин, 0.5% CHAPS, 0.1 мМ PMSF), 1 мл на 0,1-10 млнклеток, в зависимости от необходимой концентрации. Инкубировали 30 минут вольду. Центрифугировали 10 минут при 4С на 15000 об/мин и отбиралинадосадочный раствор.

Экстракт делили на аликвоты и замораживали в жидкомазоте. С полученным экстрактом проводилась теломеразная полимеразная реакция.Готовилось 28 мкл смеси 1: 1х TRAP-буфер (1х TRAP-буфер: 20 мM HEPES-KOHpH 8.3, 1,5 мM MgCl2, 63 мM KCl, 1мM EGTA, 0,1 мг/мл BSA, 0,005% v/v Tween20), по 20 мкM dNTP, 10 пмоль олигонуклеотида TS (aatccgtcgagcagagtt) и экстрактмоноцитов или клеток контрольных клеточных линий. Реакционную смесьинкубировали 30 минут при 25C.

Полученные продукты амплифицировались с113помощью ПЦР в реальном времени. К смеси добавляли 1,5 ед. Taq-ДНКполимеразы(“Хеликон”),10пмольолигонуклеотидаACX(gcgcggcttacccttacccttaccctaacc) и Sybr Green I до 0.2x концентрации в финальнойсмеси и проводилась ПЦР-рв на приборе CFX-96: 35 c 94C, 35 с 50C 90 с 72C (30циклов, амплификатор Mastercycler (“Eppendorf”, Германия)).2.4. Инструментальные методы исследования2.4.1. Определение скорости распространения пульсовой волныИзмерения СРПВ проводили каротидно-феморальным способом на прибореSphygmoCor (AtCorMedical, Австралия) согласно рекомендациям по измерениюартериальной жесткости 2012 г. [739].В основе метода лежит использование аппланационного тонометра дляполучения пульсовых волн каротидной и феморальной артерий.

СРПВрассчитывается как отношение расстояния между двумя точками регистрации ивременизапаздыванияприходаволныпоотношениюкзубцуRэлектрокардиограммы. Чрескожным датчиком измерялось время задержки междудвумя пульсовыми волнами на правой общей сонной и правой бедренной артерияхи расстояние между точками регистрации пульсовой волны. Расстояние Dизмерялось от яремной вырезки грудины до пульсации бедренной артерии впаховой области. Время (t) распространения пульсовой волны по этому участкуоценивалось с помощью зубца R на электрокардиограмме (определялось времямежду зубцом R на ЭКГ и появлением пульсации в точках регистрации сигналов).СРПВ определялась по формуле СРПВ = D × 0,8 / Δt. Выполняли дваизмерения СРПВ, перед каждым измеряли АД на левом плече автоматическимприбором OMRON M3 Expert (Omron Healthcare, HEM-7200 М3, (Киото, Япония).Для анализа выбирали значения СРПВ, в большей степени соответствующиекритериям качества измерения.

Характеристики

Список файлов диссертации