Диссертация (1174212), страница 25
Текст из файла (страница 25)
Для оценки тяжестисостояния больного и степени влияния кожного процесса на различные аспектыжизни пациента применялся опросник Дерматологического Индекса КачестваЖизни (ДИКЖ) [107]. У пациентов с аКПЛ СОПР также проводилась оценкауровня боли по визуально-аналоговой шкале (ВАШ) [57].Иммуногистохимическое исследование инцизионного (punch) биоптата очага поражения СОПР с определением локализации экспрессии Ki 67 и E-кадгеринапроводили в соответствии со стандартным протоколом.
Использовали антитела кKi 67 (1:200, «DAKO») и Е-кадгерину (1:50, «Novocastra»). Уровень пролиферации оценивался с помощью индекса, который вычислялся как среднее от числамеченных ядер на 100 учтенных ядер (при учете 500-1000 клеток очага поражения). Для оценки характера экспрессии Е-кадгерина выделялись следующие еетипы: мембранный, мембранно-редуцированный, цитоплазматический, мембранно-цитоплазматический и отсутствие иммунореактивности.148Метод прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) с применением моноспецифических люминесцирующих сывороток против Ig основных классов (G, A, M) иС3 компонента комплемента (НИИ ЭЭМ им Н.Г.Гамалеи) применялся для выявления фиксированных иммуноглобулинов и иммунных комплексов в инцизионном (punch) биоптате видимо здоровой кожи.Экспрессия антигенов на лимфоцитах определялась на проточном цитофлюориметре FACScan (Becton Dickinson) методом проточной цитофлюорометрии с применением панели моноклональных антител (МКА) (Beckman Coulter) среактогенной направленностью против дифференцировочных антигенов, а такжемаркеров активации и адгезии: CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD11b+, HLA-DR+,CD25+, CD38+.
Пациенты I и III групп дважды проходили иммунологическое обследование: до и через 7-10 дней после ЭФХТ.Процедура ЭФХТ проводилась через 1-2 дня, на курс 4 сеанса. Мононуклеарные клетки выделяли на клеточном сепараторе «HAEMONETICS MCS+»(США) по протоколу выделения стволовых клеток. За один сеанс из 450,0 мл крови выделялось около 25 мл концентрата мононуклеарных клеток. Затем клеткиресуспендировались в 0,9% растворе NaCl, общий объем доводился до 200,0 мл.После этого клеточная суспензия подвергалась ультрафиолетовому воздействиюна аппарате УФ облучения (УФО) «ЮЛИЯ» сλ380-420 нм. Общая доза экспози-ции составляла 0,8-1,2 Дж/см2.
Фотосенсибилизатор- аммифурин, применялся вдозе 0,6 мг/кг. Препарат принимался внутрь за 2 часа до проведения процедуры.После воздействия УФО, клеточная суспензия реинфузировалась пациенту в течение 30 минут [29]. При комбинированном лечении с применением ЭФХТ и метотрексата после второй процедуры ЭФХТ производилась внутримышечная инъекция метотрексата в дозе 10,0 мг, после чего проводились еще 2 процедурыЭФХТ.Все пациенты III группы были консультированы онкологом, с целью включения в комплексную терапию метотрексата. Терапия с применением метотрексата не проводилась пациентам с алкогольной зависимостью и хронической пече-149ночной недостаточностью, а также, ее также не получали беременные и фертильные, планирующие беременность женщины.При проведении статистической обработки полученных результатов, дляописания количественных данных рассчитывали средние арифмети-ческие значения и стандартные отклонения (M±SD) либо медианы и квартили (Me [LQ; UQ]),если распределение переменной отличалось от нормального.
Нормальность распределения проверяли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Для анализа взаимосвязи двух количественных переменных проводили анализ с использованием коэффициента корреляции Спирмена (с расчетом статистической значимости различий коэффициентов между группами). Сравнение количественных переменных вдвух группах проводили с использованием критерия Стьюдента или критерияМанна-Уитни (при невозможности использования критерия Стьюдента вследствие отсутствия равенства дисперсий анализируемых выборок, в случае отличияраспределений переменных от нормального).
Анализ динамических измененийпеременных внутри групп анализировали с помощью критерия Стьюдента для зависимых выборок или критерия Вилкок-сона. Для оценки различий одновременномежду тремя выборками был использован критерий Крускала-Уоллиса (с апостериорными попарными сравнениями критерием Данна с поправкой на множественные сравнения) и точный критерий Фишера с дальнейшими апостериорнымипопарными сравнениями с поправкой Бонферрони. Сравнение коэффициентовкорреляции проводили с помощью модуля «Difference tests» (программа Statistica13.2).
Полученные различия считались статистически значимыми при значениях p<0,05. Анализ проводился с использованием программ Statistica 13.2 (Dell inc.,USA), Mi-crosoft Excel 2016 (Microsoft corp., USA).аКПЛ кожи среди 97 больных КПЛ был диагностирован в 81 (83,5%) случае: гипертрофическая форма была в 31 (38,3%), пигментная – в 23 (28,4%), атрофическая –в 11 (13,6%), фолликулярная- 8 (9,9%), усеченная – в 3 (3,7%), буллезная- в 1(1,2%), эритематозная – в 1 (1,2%), ВГС- в 2 (2,5%) и синдром ГриншпанаПотекаева- в 1(1,2%) случае.150В 35 (43,2%) случаях аКПЛ кожи ассоциировался с аКПЛ СОПР: в 17(48,6%) случаях с гиперкератотическим, в 11 (31,4%)- с эрозивно-язвенным, в 7(20%)- с экссудативно-гиперемическим.В 7 (8,6%) случаях аКПЛ кожи ассоциировался с аКПЛ слизистой половыхорганов, в том числе, в 6 (85,7%) случаях с эрозивно-язвенной и в 1 (14,3%)- с гипертрофической.В 16 (16,5%) случаях аКПЛ СОПР носил изолированный характер и былпредставлен, в 6 (37,5%) случаях экссудативно-гиперемической, в 5 (31,25%) эрозивно-язвенной и в 5 (31,25%)- гиперкератотической формами КПЛ.Таким образом, аКПЛ СОПР был у 51 (52,6%) из 97 больных аКПЛ.
У 16(31,4%) была эрозивно-язвенная, у 22 (43,1%) гиперкератотическая, у 13 (25,5%)экссудативно-гиперемическая формы.Для разработки методики дифференциальной диагностики аКПЛ СОПР,лейкоплакии и плоскоклеточного рака полости рта на основе использования иммуногистохимического маркера клеток, ядра которых экспрессируют Ki 67 и Екадгерина нами было проведено иммуногистохимическое изучение 16 гистологически верифицированных биоптатов аКПЛ СОПР (6 с эрозивно-язвенной, в 5 – сгипертрофической, в 3 – с экссудативнно-гиперемической, 2 – с атрофическойформой), 13 веррукозной лейкоплакией и 7 плоскоклеточным раком полости рта.Индекс пролиферации Ki 67 в клетках аКПЛ СОПР варьировал от 6% до13% (в среднем 9,3±2,3%), а пролиферирующие клетки располагались исключительно в базальном слое эпидермиса; при лейкоплакии он варьировал от 10% до30% (в среднем 20,6±6,1%), пролиферирующие клетки располагались в 10 (66,7%)случаях в базальном слое и нижних отделах шиповатого (надбазально) слоя эпидермиса и в 3 (33,3%) случаях только в базальном слое; при плоскоклеточном раке полости рта индекс Ki 67 варьировал от 35% до 85% (в среднем 57,4±2,04%),пролиферирующие клетки располагались диффузно в составе опухолевых ком-151плексов в 6 (85,7%) случаях, а в одном (14,3%)- определялись в базальных инадбазальных отделах.Таким образом, по уровню пролиферативной активности клеток и характеру их распределения в эпидермисе атипичный красный плоский лишай слизистой оболочки полости рта существенно отличался от лейкоплакии (p=0,003) иплоскоклеточного рака той же локализации (p<0,001): средний индекс Ki 67 составлял 9,3±2,3%, 20,6±6,1% и 57,4±2,04% соответственно.Клетки, ядра которых экспрессировали Ki 67 при аКПЛ СОПР располагались в базальном слое эпидермиса в 100% клеток, при лейкоплакии – в базальномслое в 23,1%, базально и надбазально в 76,9% клеток, при плоскоклеточном раке –базально и надбазально в 14,3% клеток, диффузно в составе опухолевых комплексов в 85,7% клеток.
При попарном сравнении локализации клеток, ядра которыхэкспрессируют маркер Ki 67 различия носили достоверный характер во всех исследуемых парах (р<0,001).Е-кадгерин при аКПЛ СОПР экспрессировался на мембране в 100% клеток:в подавляющем большинстве (1680 или 98,8%) клетках имело место интенсивноемембранное окрашивание, а в 20 (1,2%) мембранно-редуцированное. Клетки лейкоплакии в 90,7% экспрессировали Е-кадгерин на мембране: в 1043 (80,2%) случаях клетки имели мембранный тип экспрессии, в 137 (10,5%) – мембранноредуцированный;в50(3,9%)клеткахопределялсямембранно-цитоплазматический тип экспрессии и в 70 (5,4%) случаях клетки не имели иммунореактивности. При плоскоклеточном раке в 53,7% клеток отмечалась цитоплазматическая экспрессия: 355 (50,9%) клеток экспрессировали маркер в цитоплазме,20 (2,8%) клеток имели мембранно-цитоплазматическую экспрессию.
В 250(35,7%) клетках иммунореактивность отсутствовала и лишь 10,6% клеток экспрессировали Е-кадгерин на мембране: 30 (4,2%) имели мембранный тип экспрессии, 45 (6,4%) – мембранно-редуцированный.Полученные данные свидетельствовали о существенных различиях по уровню пролиферативной активности клеток атипичного красного плоского лишая слейкоплакией (р=0,003) и плоскоклеточным раком (р<0,001) и по характеру их152распределения в эпидермисе при каждом из заболеваний, поскольку при аКПЛСОПР 100% клеток располагались в базальном слое эпидермиса, при лейкоплакии– в базальном слое в 23,1%, базально и надбазально в 76,9% клеток, при плоскоклеточном раке – базально и надбазально в 14,3% клеток, диффузно в составеопухолевых комплексов в 85,7% клеток (р<0,001).При последующих попарных сравнениях было установлено, что по локализации отложений Е-кадгерина аКПЛ СОПР достоверно отличался от лейкоплакиии плоскоклеточного рака той же локализации: мембранно-редуцированная экспрессия была достоверно выше при лейкоплакии, чем при аКПЛ СОПР (10,5% и1,2% соответственно; р=0,001); при плоскоклеточном раке в 53,7% клеток отмечалась цитоплазматическая экспрессия, в 35,7% реакция отсутствовала, а приаКПЛ СОПР цитоплазматической экспрессии и отсутствия иммунореактивностине было (р<0,001).На основании полученных результаты нами предложен метод диагностикиаКПЛ СОПР, в соответствие с которым, при выявлении значений индекса пролиферации Ki 67 до 10 % и локализации клеток, ядра которых экспрессируют Ki 67исключительно в базальном слое эпидермиса, следует диагностировать аКПЛСОПР .При значении индекса пролиферации от 10 до 14% и локализации клеток,ядра которых экспрессируют Ki 67 исключительно в базальном слое эпидермисаcледует проводить дополнительное исследование с выявлением локализации экспрессии Е-кадгерина, и при его мембранной экспрессии диагностировать аКПЛСОПР.Метод использован нами в диагностике 17 больных с персистирующим (от6 месяцев до 19 лет, 1 год [10 месяцев; 2 года]) поражением слизистой оболочкиполости рта, клинически сходным с аКПЛ СОПР, лейкоплакией или плоскоклеточным раком (5 пациентов с сочетанным аКПЛ кожи и 12 пациентов с изолированными поражениями) и выявил у 10 больных аКПЛ СОПР (у 6 эрозивноязвенный, у 4-экссудативно-гиперемический,у 2 - гиперкератотический), у 6 –лейкоплакию полости рта, у одного – плоскоклеточный рак полости рта.153Применение иммуногистохимического исследования с антителами к Ki 67 иЕ-кадгерину позволило исключить возможность ошибочного включения в III и IVгруппы больных с лейкоплакией и раком полости рта, обеспечив тем самым однородность сравниваемых группах для получения репрезентативных данных об использования ЭФХТ в комплексе с однократной внутримышечной инъекцией 10,0мг метотрексата.При иммунологическом обследовании пациентов I группы отмечалось статистически значимое увеличение количества эффекторных CD3+CD8+ (0,53 [0,37;0,68] 109/л;) клеток, по сравнению со здоровыми донорами (0,32±0,07 109/л),(p<0,01).Отмеченная нами в этой группе больных статистически значимая корреляционная зависимость CD3+CD8+ с активационным антигеном CD38+ (r=0,54,p<0,05) свидетельствовала о высокой активности этих клеток.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
